桃pgip基因cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

论文摘要

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase inhibiting proteins，PGIPs）是一种胞外的细胞壁结合糖蛋白，在植物的防卫反应中具有重要的作用。它能够特异性结合病原真菌分泌的内切多聚半乳糖醛酸酶并抑制其水解活性，限制植物致病真菌的生长，同时引发植物的防卫反应。它还与大多数植物抗性基因一样，属于富亮氨酸重复（Leucine-rich repeat，LRR）蛋白超家族。pgip基因在植物抗病育种中已成为一重要的候选基因，其分离鉴定是进行转基因研究的基础。根据李属pgip基因序列保守区域设计一对特异引物，以桃（Prunus persica（L．）Batch）叶片制备的总RNA为模板，采用反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术，克隆到了约1，000 bp的cDNA片段。该片段与pMD 18-T载体连接后转化Escherichia coli JM109，对筛选到的阳性克隆进行序列测定与分析结果表明，获得的cDNA长1，053 bp，是桃的pgip基因，命名为Pppgip，GenBank登录号为EF409977。该片段含完整的开放阅读框990 bp，编码330个氨基酸残基组成的蛋白质，具有7个潜在的N-糖基化位点。预测该蛋白质分子量为36.4 kDa，等电点为7.42，N端24个氨基酸残基构成的疏水区域为信号肽。序列同源比对结果显示，所克隆的Pppgip基因与李属其它pgip基因核苷酸序列的同源性为93.2～94.6％，推导氨基酸序列的同源性为89.7～92.7％；同源树表明其明显区别于其它pgip基因；进一步的系统进化树分析表明，所克隆的Pppgip基因与马哈利樱桃（P．mahaleb L．）的pgip基因关系较近，而与寿星桃（P．persica L．var．densa Makino）、桃栽培品种‘久保’（P．persica（L．）Batch）等pgip基因都存在较远的进化关系。采用SyPred3D软件预测了该基因所编码的蛋白质的三维结构，表明PpPGIP的三维模型类似马蹄形的结构，含11段α-螺旋和21段β-折叠，具有8个β-折叠／β-转角／β-折叠／α-螺旋区，中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。将该基因成熟肽编码区序列克隆到pET-32a（+）表达载体中，分别构建了融合表达质粒（pET-FPGIP）和非融合表达质粒（pET-PGIP），在E．coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中通过IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析表明获得了该基因的重组蛋白，重组蛋白主要以包涵体形式出现，融合表达产物中仍有部分可溶形式蛋白。桃pgip基因的克隆和表达将为进一步研究桃PGIP的功能以及PGIPs-PGs相互作用打下了一定的基础，也为植物抗真菌病害分子育种提供了重要的参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 1.文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPs）研究进展
• 1.2.1 PGIPs的发现及其功能
• 1.2.2 编码PGIPs的基因
• 1.2.3 PGIPs对PGs的抑制及其结构特点
• 1.2.4 pgip的表达及其调控
• 1.2.5 pgip基因的异源表达研究
• 1.3 论文选题的目的意义
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 试剂与试剂盒
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 溶液和缓冲液
• 2.1.7 引物
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 桃叶片总RNA的提取
• 2.3.2 电泳技术
• 2.3.3 RNA OD值的测定
• 2.3.4 反转录
• 2.3.5 PCR
• 2.3.6 DNA片段的回收
• 2.3.7 DNA片段和载体DNA的连接
• 2.3.8 大肠杆菌的转化
• 2.3.9 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.3.10 限制性内切酶酶切反应
• 2.3.11 DNA序列测定和分析
• 2.3.12 重组Pppgip基因在大肠杆菌中的表达
• 3.结果与分析
• 3.1 克隆及表达策略
• 3.2 RNA提取及检测
• 3.3 RT-PCR
• 3.4 阳性克隆的筛选和鉴定
• 3.5 桃pgip基因序列分析与三维结构预测
• 3.5.1 测序结果
• 3.5.2 桃PGIP信号肽预测
• 3.5.3 桃PGIP氨基酸组成及密码子偏爱性
• 3.5.4 pgip cDNA序列及其编码氨基酸序列同源性分析
• 3.5.5 进化树分析
• 3.5.6 PpPGIP蛋白质亲水性和疏水性分析
• 3.5.7 PpPGIP蛋白质三维模型构建
• 3.6 重组Pppgip cDNA在大肠杆菌中的表达
• 4.讨论
• 4.1 RNA的提取及检测
• 4.2 cDNA片段的密码子偏爱性分析
• 4.3 pgip基因同源性及进化关系的分析
• 4.4 pgip基因在大肠杆菌的表达
• 5.小结
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的论文