绵羊毛囊培养方法的建立及雌二醇对毛囊Bcl-2、Bax表达的影响

论文摘要

毛囊是皮肤重要而复杂的附属器官,从内向外依次由毛根、内根鞘和外根鞘组成。本实验通过对绵羊毛囊的显微分离、培养,倒置显微镜观察培养毛囊早、中、后期的组织形态变化规律。目镜测微尺测量毛囊长度,同时做离体培养毛囊组织学检测,探讨体外培养毛囊的生长和周期性再生的变化特点和影响因素,从而建立了绵羊毛囊的理想的体外培养体系,为进一步研究奠定了基础;在体外培养体系中加入17-β-雌二醇,并运用RT-PCR方法、组织化学方法、实时荧光定量研究检测了雌激素对培养毛囊形态的影响及分子生物学方面培养毛囊中细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达与激素之间的相互关系。结果如下:1.生长期毛囊的鉴定结合运用显微解剖法、剪刀法、酶消化法等方法,成功地分离出了完好无损生长期毛囊。经形态学、组织切片方法鉴定,毛乳头显示为清晰椭圆,细胞紧凑且为洋葱头的纵切面形状（如图2-21～2-23）,毛囊内根鞘、外根鞘、毛根清晰可见,即所培养毛囊为生长期健康正常的毛囊,可以作为研究绵羊皮肤毛囊Bcl-2、Bax表达与激素关系的研究模型毛囊。毛乳头显示为模糊发暗无固定形状,内根鞘、外根鞘、毛干发黑毛乳头不可见,即为非生长期毛囊。本实验使用的毛囊均为生长期毛囊。2.体外培养绵羊毛囊体系的建立利用生长期健康正常的毛囊,在不同条件、不同培养液中对比培养并得出结果: 31℃、饱和湿度、5% CO2浓度的体外培养条件下,在Williams E无血清培养液中加入L-谷氨酰胺2mmol/l、Hepes 2mmol/l、胰岛素10μg/ml、转铁蛋白10μg/ml、氢化可的松10ng/ml、亚硒酸钠10ng/ml、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml的体系是最佳选择。3.该体系中培养毛囊的特征:成活率达87.25%,前1～10天增长最快,前10天平均增长长度为0.36mm/d;一般15～20天都不会贴壁,前15天毛囊的形态没有明显的改变,生长后期,毛乳头紧凑成一团,且变得越来越小,整个毛囊变细。培养22天后毛囊出现贴壁,角朊细胞从外根鞘中迁出,毛囊生长减慢,从毛球至毛干逐渐发暗发黑外根鞘向外发散,表现明显的退化状态,但毛囊仍存活,总的趋势是体外培养毛囊随时间后移形态结构由清晰逐渐变为模糊。4.雌激素（17-β-雌二醇）对毛囊生长的影响在已建立好的体系中游离毛囊培养1天后筛选出生长较好的毛囊（增长速度≥0.1mm/d）,再更换添加有不同浓度雌激素的新的无血清培养液,运用倒置显微镜观察、目镜测微尺测量培养毛囊增长长度、制作培养毛囊早、中、后期的组织切片,对比观察其组织形态变化规律,记录结果并照相、数据统计分析。结果显示:雌激素对毛囊的生长有抑制作用,但有个别浓度（如:10-8mol/l）长势好于阴性对照,原因是该浓度接近体内正常生长浓度,此时体外培养毛囊生长环境接近体内稳定状态,所以长势好。10-10～10-9mol/l及10-7mol/l浓度的17-β-雌二醇对毛囊的生长有明显抑制作用。5. 17-β-雌二醇对凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达的影响本研究是在通过SYBR Green I荧光染料实时定量PCR方法,使SYBR Green I与DNA双链相结合。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱的原理,运用RT-PCR技术,对比研究凋亡调控基因Bcl-2、Bax在体外培养绵羊毛囊群中各个时间段的表达水平及两种基因表达与17-β-雌二醇之间的关系。从反转录水平评估及鉴定细胞凋亡相关基因的相互关系显示:（1） Bcl-2表达情况,体外培养1～6天的绵羊皮肤毛囊群Bcl-2表达情况:体外培养1～6天的绵羊皮肤毛囊群Bcl-2表达随雌激素浓度10-10mol/l至10-7mol/l范围内,呈现“倒V字”型表达,在10-8mol/l浓度中表达量达顶峰,但这浓度中的表达量远不如阴性对照组中的表达量高。对照组与其它不同浓度雌激素组之间差异极显著（p<0.01）。（2） Bax表达情况:体外培养1～6天的绵羊皮肤毛囊群Bax表达随雌激素浓度10-10mol/l至10-7mol/l范围内,与Bcl-2的表达趋势相似,也呈“倒V字”型表达,但表达量过低。（3） Bcl-2和Bax表达量的比值:培养1～6天的绵羊毛囊群Bcl-2和Bax表达量的比值比较,10-8mol/l浓度组极显著高于其它各组（p<0.01）。（4）在试验检测的培养1～6天的绵羊毛囊群Bcl-2、Bax表达中,Bcl-2/Bax值与培养毛囊形态学观察到的规律是一致的。在体外培养蒙古绵羊毛囊生长发育过程中,Bcl-2和Bax共同参与了凋亡的调节作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 毛囊结构研究的进展
• 1.1.1 毛囊的基本结构
• 1.1.2 毛囊的组织发生
• 1.1.3 毛与毛囊的周期性变化
• 1.1.4 影响毛囊生长相关因子的研究进展
• 1.1.5 毛囊干细胞的研究进展
• 1.1.6 毛囊体外培养的研究现状
• 1.1.7 毛囊的分离方法
• 1.1.8 毛囊的培养
• 1.1.9 毛囊体外培养主要的研究模型
• 1.2 毛囊体外培养研究的价值及前景
• 1.2.1 离体毛囊体外培养的应用
• 1.2.2 离体毛囊体外培养在雄激素源性脱发治疗中的应用
• 1.2.3 离体毛囊体外培养在痤疮治疗中的应用
• 1.3 毛囊体外培养的研究要解决的问题
• 1.4 毛囊细胞凋亡的研究进展
• 1.4.1 细胞凋亡的研究
• 1.4.2 细胞凋亡的基因调控
• 1.5 毛囊细胞凋亡的研究现状及研究意义
• 1.6 PCR 技术进展
• 1.6.1 定量PCR 方法研究进展
• 1.6.2 竞争性RT-PCR 方法原理
• 1.6.3 基因组文库
• 1.6.4 cDNA 基因文库
• 1.6.5 PCR 法分离目的基因
• 1.7 定量PCR
• 1.7.1 常用的实时定量PCR 方法
• 1.7.2 影响QRTPCR 的因素
• 1.7.3 Ct 值
• 1.8 RT-PCR 简介
• 1.8.1 RT-PCR 引物的选择
• 1.8.2 RT-PCR 影响因素
• 1.9 我们开展绵羊皮肤毛囊培养的目的与意义
• 2 实验一不同培养条件对体外培养绵羊毛囊生长的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验药品与试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 溶液的配置
• 2.2.2 绵羊皮肤毛囊的分离
• 2.2.3 Sacpic 染色
• 2.2.4 绵羊皮肤毛囊HE 染色
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 培养毛囊的形态观察
• 2.3.2 培养毛囊的组织结构观察
• 2.4 讨论
• 2.4.1 能挑选出完好无损健康的生长期毛囊是体外培养毛囊研究的首要问题
• 2.4.2 绵羊皮肤毛囊培养液的选择是体外培养毛囊研究的核心问题
• 2.4.3 绵羊皮肤毛囊培养液相关因子的加入
• 2.4.4 绵羊皮肤毛囊培养条件的选择
• 2.4.5 毛囊的体外生长特点的分析
• 2.5 结论
• 3 实验二17-β-雌二醇对体外培养毛囊生长影响的形态学上的观察
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器与主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 溶液的配置
• 3.2.2 绵羊皮肤毛囊的分离
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 培养毛囊的形态观察
• 3.3.2 不同浓度17-β-雌二醇组与对照组之间的对比观察结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 生理状态下雌激素和实验中 17-β-雌二醇的浓度确定
• 3.4.2 雌激素对毛囊和毛发生长的影响
• 3.4.3 雄激素对毛囊和毛发生长的影响
• 3.5 结论
• 4 实验三 蒙古绵羊皮肤毛囊 Bcl-2、Bax 基因表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验动物及组织
• 4.1.2 主要仪器和试剂
• 4.1.3 PCR 引物的设计及合成
• 4.1.4 蒙古绵羊皮肤毛囊群总 RNA 的提取及检测
• 4.1.5 RT-PCR 产物 cDNA 的序列测定
• 4.1.6 序列分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 蒙古绵羊皮肤毛囊总 RNA 的检测结果
• 4.2.2 蒙古绵羊皮肤毛囊 RT-PCR 扩增结果
• 4.2.3 蒙古绵羊皮肤毛囊 PCR 产物的序列分析结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 Bcl-2、Bax 的表达
• 4.3.2 蒙古绵羊皮肤毛囊 Bcl-2、Bax 基因表达情况
• 4.3.3 提取样品总RNA 时注意的问题
• 4.4 结论
• 5 实验四 实时定量 PCR 检测 17-β-雌二醇对培养毛囊 Bcl-2、Bax 表达的影响
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料处理同本论文4.1.1
• 5.1.2 实验材料
• 5.1.3 仪器及试剂
• 5.1.4 PCR 引物的设计及合成
• 5.2 实验设计
• 5.2.1 添加雌激素 17-β-雌二醇
• 5.2.2 毛囊总RNA 的提取
• 5.2.3 荧光定量 RT-PCR 检测培养的毛囊 Bcl-2、Bax 表达的定量方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 荧光定量 RT-PCR 检测培养的毛囊 Bcl-2、Bax 表达定量方法的确定
• 5.3.2 添加 17-β-雌二醇对培养毛囊 Bcl-2 和 Bax 表达的影响
• 5.4 讨论
• 5.4.1 毛囊群的培养
• 5.4.2 Bcl-2 的表达
• 5.4.3 Bax 的表达
• 5.4.4 Bcl-2、Bax 基因在毛囊中表达的意义
• 5.4.5 PCR 反应体系的探讨
• 5.5 结论
• 6 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介