论文摘要
姜瘟病是生姜生产中普遍发生的一种毁灭性土传病害，是由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacerum）引起的一种细菌性青枯病。从姜瘟病发病田块分离到的蜡状芽孢杆菌J1，对姜瘟病病原菌有很好拮抗作用，具有进一步研究的价值。将拮抗菌J1在30℃，120r／min发酵培养55h后，以60％饱和度的硫酸铵提取发酵液中的拮抗蛋白，采用环柱测定法测定了拮抗蛋白对胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等8种病原菌的拮抗谱，结果表明拮抗蛋白对西瓜枯萎病菌（Fusarium．oxysporum f．sp．niveum）、玉米枯萎病菌（Fusarium．oxysporum f．sp．zeae）有很好的拮抗活性，拮抗带宽度达到10～15mm，对胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）等其它6种病原菌也有较好的拮抗活性。拮抗蛋白经不同因素处理的试验得出，拮抗蛋白经40～80℃温度范围内处理后，有较好的拮抗活性，100℃处理30min后拮抗活性丧失；经不同pH值处理后，在pH4～8都具有活性，中性pH条件下活性最强；在不同光源照射条件下，直接光照及紫外线照射对J1菌株活性物质的拮抗活性影响不大，与黑暗条件下保存相比，拮抗活性没有改变，可见该拮抗活性物质为光稳定性物质；拮抗蛋白经胰蛋白酶（100mg／mL）在37℃下处理90min后，环柱法测定未见拮抗圈，说明拮抗蛋白被酶解，活性消失。通过pH8.0，200mmol／LTris-HCl缓冲液平衡Econo-Pac Q离子交换柱，以2mL／min的流速，0～1mol／L的NaCl的缓冲溶液，梯度式洗脱以纯化拮抗拮抗蛋白，通过生物活性测定和SDS-PAGE分析表明纯化得到的拮抗蛋白表观分子量为45KD。采用多种方法对拮抗菌J1进行诱变改良，紫外线（UV）诱变试验结果表明，在60s～90s时间范围，致死率80％～90％的条件下能够取得较为理想的诱变效果；甲基磺酸乙脂（EMS）诱变试验结果表明，采取低剂量长时间处理，可以达到高正突变率，获得多株高产菌株的目的；UV诱变和氯化锂（Licl）的复合诱变结果表明，UV60s和1.2％浓度的Licl复合诱变效果最好；而吖啶橙对出发菌株的诱变效果很差，没有得到正突变菌株。通过多次筛选得到改良菌株EMS—2，其发酵液的蛋白质效价为22.79ug／mL较出发菌株的蛋白质效价17.84ug／mL提高了30.38％。将EMS—2菌株通过原生质体的形式，进一步进行诱变改良。试验得出原生质体制备的最佳条件为，溶菌酶浓度0.5mg／mL，30℃条件下处理30min。从EMS—2原生质体的紫外线（UV）诱变结果发现，60s前原生质体经紫外线照射的致死率远远小于拮抗菌J1经紫外线照射时的致死率，与试验预期相反，这可能与高渗溶液的保护有关。紫外线照射在50s时正突变率达到最大（为35.8％较拮抗菌J1在紫外线诱变条件下的最高突变率高11％）。说明紫外线在低剂量时对原生质体的诱变效果较好。将得到的改良菌株UP—9采用原生质体形式以EMS继续进行诱变试验，结果表明说明EMS对原生质体的的致死作用极强。在诱变处理35min后正突变率达到最大（31.3％）。通过对拮抗菌J1的连续诱变筛选，最终得到改良菌株EP-5，该改良菌株的发酵液蛋白质效价为46.37mg／mL较拮抗菌J1发酵液蛋白质效价（17.84ug／mL）提高了1.65倍。