家蚕核型多角体病毒（BmNPV）ORF67、ORF101基因分析

论文摘要

杆状病毒（baculovirus）是具有高度宿主特异性的一类节肢动物病毒。近年来,杆状病毒在杆状病毒表达系统、重组杆状病毒杀虫剂、杆状病毒基因治疗载体和杆状病毒表面展示系统等方面得到了大量的运用。从已鉴定的基因分析可以看出,大部分基因参与了病毒的复制、转录、组成等各方面,到目前为止还有部分基因功能没有研究报道。本论文选择了家蚕核型多角体病毒（Bombyx morinucleopolyhedrovirus,BmNPV）ORF67和ORF101两个功能未知的杆状病毒基因为研究对象,对基因转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位、基因缺失进行了分析,为进一步解析病毒与宿主相互关系奠定基础。本论文主要结论如下:BmORF67基因位于BmNPV基因组61188 nt～61892 nt之间,阅读框全长705bp,编码234个氨基酸,预计分子量为27kDa;BmORF67是一个保守性很强的蛋白,在所有已测序的杆状病毒基因组里都能找到同源基因。BmORF101基因位于BmNPV基因组95620nt～96354nt之间,全长735bp,编码的蛋白包含244个氨基酸,预计分子量为28.1kDa;进行序列及同源性比较,结果表明,有11个杆状病毒编码的蛋白与BmORF101蛋白同源。本文首先根据BmORF67基因序列设计引物,分别以BmNPV基因组DNA为模板进行PCR扩增,将得到的基因克隆至原核表达载体pET30a（+）,在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备了BmORF67蛋白的多克隆抗体。BmORF67多克隆抗血清与BmNPV感染的BmN细胞总蛋白进行的杂交,显示一条27kDa的特异杂交带,该蛋白带与推测的大小一致。RT-PCR分析结果表明,BmORF67基因在病毒感染细胞中的转录均从18 h开始就可以检测到,一直持续到感染后72 h。与基因从病毒感染后18 h开始转录不同的是,BmORF67蛋白的表达是从感染后24 h才开始检测到。利用Western blot方法检测分离出的BV、ODV粒子表明,BmORF67不是病毒粒子的结构蛋白。为了确定BmORF67的亚细胞定位,免疫杂交后直接用免疫荧光共聚焦显微镜进行观察,可见荧光全部集中在细胞质中。用Pull-down技术和免疫共沉淀分析与BmORF67互作的蛋白,MALDI-TOF质谱鉴定出actin A3蛋白与BmORF67存在相互作用。这一结果与BmORF67定位于细胞中的情况相符。本文第二部分内容是采用Red重组系统的方法,在大肠杆菌DH10B细胞中成功实现了从BmNPV Bacmid基因组中敲除BmORF101基因片段,并同时在该位点插入了氯霉素基因Cm。将经过转座带有绿色荧光蛋白基因（green flucrescenceprotein,gfp）和多角体基因（polh）的重组Bacmid转染BmN细胞,24h后荧光显微观察发现细胞中能够产生绿色荧光,出现荧光的细胞零星分布,从转染后24-96h有荧光的细胞数量基本不变。重组Bacmid转染BmN细胞,病毒上清的滴度测定结果全部为零。构建的BmORF101基因拯救病毒,DNA转染细胞后产生的病毒可以不断感染邻近细胞,说明病毒又恢复了感染能力。二次感染试验进一步证明,BmORF101缺失病毒丧失了BV产生能力,而拯救型病毒则表现出野生病毒应有的特性。这些结果充分表明BmORF101缺失导致芽生型病毒粒子（budded virus,BV）不能产生,BmORF101是BV产生的必需基因。对BmORF101基因的RT-PCR分析表明,BmORF101转录始于感染后24h,并且一直持续到感染后期。利用BmORF101与GFP融合对其亚细胞定位进行了观察,发现BmORF101在转染的起始阶段荧光聚集在细胞质中,到了转染后期,在细胞核中也能观察到少量荧光。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 杆状病毒及其应用
• 1.2 杆状病毒的生活周期
• 1.3 杆状病毒的结构
• 1.4 杆状病毒的基因组成
• 1.4.1 杆状病毒基因组序列
• 1.4.2 已经鉴定的杆状病毒基因
• 1.5 病毒入侵过程中ODV囊膜蛋白所起的作用
• 1.5.1 ODV-E66
• 1.5.2 ODV-E25（P25）
• 1.5.3 ODV-EC27
• 1.5.4 P74
• 1.6 病毒入侵过程中BV囊膜蛋白所起的作用
• 1.7 与病毒基因表达调节有关的基因
• 1.8 肌动蛋白与杆状病毒
• 1.8.1 肌动蛋白在细胞内生理功能的多样性
• 1.8.2 杆状病毒与宿主细胞肌动蛋白相互作用的研究
• 1.8.3 宿主细胞激动蛋白在杆状病毒入侵过程中的变化
• 1.8.4 杆状病毒可能参与肌动蛋白相互作用的蛋白
• 第2章 杆状病毒BmORF67和BmORF101基因的序列分析
• 2.1 基因序列及分析方法
• 2.1.1 BmORF67和BmORF101基因序列
• 2.1.2 计算机软件及分析方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 BmORF67基因阅读框分析
• 2.2.2 BmORF101基因阅读框分析
• 2.2.3 BmORF67和BmORF101蛋白二级结构分析
• 2.2.4 BmORF67蛋白同源性比较
• 2.2.5 BmORF101蛋白同源性比较
• 2.3 讨论
• 第3章 杆状病毒BmORF67克隆及其在原核细胞中的表达与抗体制备
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 BmORF67基因的克隆
• 3.2.2 BmORF67基因的原核表达
• 3.2.3 融合蛋白6×His接头的鉴定
• 3.2.4 目的蛋白的纯化
• 3.2.5 BmORF67蛋白抗体的制备与检测
• 3.2.6 BmORF67蛋白抗体在真核细胞中的检测
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 杆状病毒BmORF67基因的转录、表达研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 BmORF67的转录时相
• 4.2.2 BmORF67的表达时相
• 4.2.3 BmORF67蛋白在病毒结构中的定位
• 4.2.4 BmORF67的亚细胞定位
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 与BmORF67互作蛋白的分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 Pull-down分析
• 5.2.2 免疫共沉淀分析
• 5.2.3 质谱鉴定Pull-down和免疫共沉淀产物
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第六章 BmORF101基因缺失和拯救的重组Bacmid的构建
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 U、Cm、D片段的PCR扩增结果
• 6.2.2 重组质粒pUC-UCmD的酶切鉴定
• KO的PCR鉴定'>6.2.3 重组质粒pBm^KO的PCR鉴定
• 6.2.4 供体质粒pFPG和pFPG-101repair的PCR鉴定
• KO-PG、pBm^WT-PG和pBm^{KO-PG-101repair}的PCR鉴定'>6.2.5 重组BacmidpBm^KO-PG、pBm^WT-PG和pBm^{KO-PG-101repair}的PCR鉴定
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 BmORF101基因的研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 质粒载体
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果
• 7.2.1 BmORF101基因的转录时相
• KO-PG、pBm^WT-PG和pBm^{KO-PG-101repair}转染BmN细胞不同时间的荧光显微观察'>7.2.2 pBm^KO-PG、pBm^WT-PG和pBm^{KO-PG-101repair}转染BmN细胞不同时间的荧光显微观察
• KO-PG、pBm^WT-PG和pBm^{KO-PG-101repair}转染BmN细胞BV增长曲线测定'>7.2.3 pBm^KO-PG、pBm^WT-PG和pBm^{KO-PG-101repair}转染BmN细胞BV增长曲线测定
• KO及vBm^WT感染性的检测结果'>7.2.4 vBm^KO及vBm^WT感染性的检测结果
• KO和vBm^WT基因组的检测'>7.2.5 vBm^KO和vBm^WT基因组的检测
• WT和vBm^repair感染BmN细胞BV增长曲线测定'>7.2.6 vBm^WT和vBm^repair感染BmN细胞BV增长曲线测定
• 7.2.7 BmORF101的亚细胞定位
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 总结和展望
• 总结
• 对下一步工作的思考
• 本研究创新点
• 参考文献
• 致谢
• 读博期间发表的研究论文和参加的课题