苦参素及间充质干细胞抗大鼠肾缺血—再灌注损伤的作用及机制研究

论文摘要

研究背景和目的肾脏的缺血-再灌注损伤是一种复杂的病理生理过程，在很多情况下均可发生，如肾移植、肾部分切除术、血管外科手术等，是临床上导致肾细胞死亡、肾功能衰竭、移植物的功能延迟以致被排斥的主要原因之一，死亡率较高，并且存活的患者也会发生不同程度的慢性肾功能损害。肾脏产生缺血-再灌注损伤的潜在机制可能与多种相互独立的因素有关，如组织缺氧、自由基损伤以及炎症应答反应。苦参素（oxymatrine，OMT）是从中药苦参（Sophora flavescens Ait.）中提取的一种具有多种药理活性生物碱。研究发现OMT具有抗凋亡、抗病毒、抗炎症反应、抗氧化、抗感染、抗心律失常以及心血管等方面具有重要的药理作用和临床用途。近年来研究发现其具有保护脏器缺血再灌注损伤的作用，但尚未见苦参素抗肾缺血再灌注损伤的报道。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一种多潜能的干细胞，具有多向分化潜能，如：成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。MSCs自身非免疫源同时具有免疫调节能力，还能够迁移至受损组织处促进损伤组织修复。临床前实验显示输注MSCs有治疗肾脏损伤的潜力。但是现在大多数的治疗策略都是通过全身给药法，如动脉注射（i.a.）、静脉注射（i.v.）及腹腔注射（i.p.）等，这些输注方法都可能造成MSCs被非损伤器官俘获而造成浪费，因而需要高剂量的细胞，从经济的角度看这样会限制其临床应用的可行性。因此，本研究探讨了不同剂量苦参素对肾脏IRI的保护作用及其可能的作用机制。另外，我们尝试进行了新的MSCs给药方法-包膜下注射给药，并研究给药剂量与其对肾保护程度是否存在剂量反应关系。最后我们选取苦参素与MSCs的最优剂量进行联合处理肾脏IRI，探讨二者联合用药是否对肾脏保护有增益效果。方法健康雌性SD大鼠，SPF级，210260g，随机分为三大组：分别为假手术组（sham operated group, S）、缺血-再灌注组（ischemia-reperfusion group, I/R）、实验处理组（treatment group, T）。实验中的手术操作主要包括肾脏缺血再灌注模型的建立和肾包膜下注射。我们采用双肾肾蒂夹闭45min来建立IRI模型。本研究共分为四个部分：1.不同剂量苦参素抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用测定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）评价肾功能；HE染色观察肾组织病理学形态改变，评价不同剂量苦参素抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用。2.苦参素抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的研究测定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）评价肾功能；应用分光分析法测定肾组织丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性探讨苦参素抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的机制。3.不同剂量间充质干细胞（MSCs）抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用测定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）评价肾功能；HE染色观察肾组织病理学形态改变，评价不同剂量MSCs抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用。4.苦参素与MSCs联合抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用测定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）评价肾功能，评价苦参素与MSCs联合抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用。结果1.实验结果表明，再灌注5h后，与sham组相比，各剂量给药组及I/R组的Scr水平都明显升高（P<0.05）；再灌注72h后，与I/R组比较，苦参素高剂量组（H-OMT-I/R组）和苦参素中剂量组（M-OMT-I/R组）的Scr水平明显降低（P<0.05）。缺血再灌注损伤后出现严重的瘀血，管型明显，有部分组织出现空泡，各治疗组有不同程度的改善。2.实验结果表明，再灌注72h后，与I/R组比较，苦参素治疗组的血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）均水平明显降低（P<0.05）；CAT、T-SOD、GSH-Px活性改善（P﹤0.05），MDA水平下降明显（P﹤0.05）。3.缺血再灌注72h后病理检查发现，I/R组肾小管上皮细胞肿胀，出现空泡变性，肾小管扩张，内可见管型（包括红细胞管型）和坏死脱落细胞，部分肾小管结构毁损，管周血管明显扩张淤血。MSCs治疗的各组均表现出损伤明显减轻情况，肾小管轮廓尚清晰，基底膜保留较完整，肾小管管腔中未见明显管型及堵塞，间质内仅可见少许红细胞。实验结果表明，与Day0相比，在缺血再灌注手术之后，各组的Scr与BUN水平明显升高（P<0.05）；再灌注后的每个时间点，与I/R组比较，各剂量组均可通过降低Scr水平来促进肾功能恢复，其中高剂量组第一天和第二天的Scr水平明显低于其他各组（P<0.05），在第三天时，与I/R组比较，各剂量组的Scr与BUN水平均明显降低（P<0.05）。4.实验结果表明，再灌注72h后，与I/R组比较，各个处理组的血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）均水平明显降低（P<0.05）。结论肾缺血-再灌注可以损伤大鼠肾结构和功能，表现为Scr和BUN升高，肾小球、肾小管受损，MDA含量升高，CAT、SOD和GSH-Px活性降低。苦参素和MSCs干预均可减轻肾组织结构的损伤具有显著的抗大鼠肾IRI的作用。其中苦参素抗大鼠IRI的作用机制与抗氧化有关，可能是通过清除氧自由基和抑制脂质过氧化，平衡氧化-抗氧化机制，来提高组织抗氧化能力。苦参素与MSCs联合用药可以有加强IRI后肾功能的修复的趋势。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 不同剂量苦参素抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 实验动物
• 2.2 主要试剂和仪器设备
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器与设备
• 3 方法
• 3.1 实验设计
• 3.1.1 肾脏缺血-再灌注损伤动物模型复制
• 3.1.2 动物分组
• 3.2 观测指标与方法
• 3.2.1 标本采集
• 3.2.2 组织固定及 HE 染色
• 3.2.3 光镜观察肾组织病理学形态改变
• 3.2.4 肾功能测定
• 3.3 统计学分析
• 4 结果
• 4.1 肾组织病理形态学变化
• 4.2 肾功能测定
• 4.2.1 血清肌酐（Scr）的变化
• 4.2.2 尿素氮（BUN）的变化
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 第二部分 苦参素抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤机制的研究
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 实验动物
• 2.2 主要仪器和设备
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器与设备
• 3 方法
• 3.1 体内抗氧化动物实验
• 3.1.1 分组
• 3.1.2 给药
• 3.1.3 手术过程
• 3.2 观测指标与方法
• 3.2.1 标本采集
• 3.2.2 肾功能测定
• 3.2.3 肾组织丙二醛（MDA）含量测定
• 3.2.4 肾组织过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 3.2.5 肾组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定
• 3.2.6 肾组织总超氧化物歧化酶 （T-SOD）活性测定
• 3.3 体外抗氧化实验
• 3.4 统计学分析
• 4 结果
• 4.1 肾功能测定
• 4.2 体内抗氧化指标测定
• 4.3 体外抗氧化指标测定
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 第三部分 间充质干细胞（MSCs）抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 实验动物
• 2.2 主要试剂和仪器设备
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器与设备
• 3 方法
• 3.1 实验设计
• 3.1.1 肾脏缺血-再灌注损伤动物模型复制
• 3.1.2 大鼠骨髓 MSCs 分离及培养纯化
• 3.1.3 成骨细胞诱导
• 3.1.4 成脂肪细胞诱导
• 3.1.5 流式细胞术鉴定
• 3.1.6 肾包膜下 MSCs 的注射
• 3.1.7 动物分组
• 3.2 观测指标与方法
• 3.2.1 标本采集
• 3.2.2 组织固定及 HE 染色
• 3.2.3 光镜观察肾组织病理学形态改变
• 3.2.4 肾功能测定
• 3.3 统计学分析
• 4 结果
• 4.1 MSCs的体外分离培养纯化及鉴定
• 4.1.1 MSCs的体外分离培养
• 4.1.2 MSCs的成骨诱导
• 4.1.3 MSCs的成脂诱导
• 4.1.4 MSCs流式细胞仪鉴定
• 4.2 肾组织病理形态学变化
• 4.3 肾功能测定
• 4.3.1 血清肌酐（Scr）的变化
• 4.3.2 尿素氮（BUN）的变化
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 第四部分 苦参素与MSC联合抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 实验动物
• 2.2 主要试剂和仪器设备
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器与设备
• 3 方法
• 3.1 实验设计
• 3.1.1 分组
• 3.1.2 给药
• 3.1.3 肾缺血再灌注模型的复制及包膜下注射
• 3.2 观测指标与方法
• 3.2.1 标本采集
• 3.2.2 肾功能测定
• 3.3 统计学分析
• 4 结果
• 4.1 肾功能测定
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 主要学习工作经历
• 研究生期间发表及参与发表的论文
• 致谢
• 综述：肾脏移植缺血再灌注损伤的预防和治疗研究进展
• 1 病理生理过程
• 2 新治疗方案
• 2.1 细胞对缺氧的适应反应
• 2.2 再灌注阶段
• 2.3 灌注后的修复阶段
• 参考文献