鞘脂激活蛋白C促进前列腺癌细胞增殖、上调AR功能的分子机制研究

论文摘要

鞘脂激活蛋白原（Prosaposin）是一种高度保守的热稳定糖蛋白（65-72kDa,527氨基酸残基）,其基因位于10号染色体长臂（q21—22）,全长17kb,有14个外显子。鞘脂激活蛋白原经水解后产生4种热稳定糖蛋白——鞘脂激活蛋白A、B、C、D（SaposinA、B、C、D）,它们在溶酶体酶解鞘脂的过程中发挥重要作用。另外,作为一种分泌蛋白,鞘脂激活蛋白原还具有神经营养作用,能够促进神经胶质源性细胞突触增长、细胞增殖以及增加其抗凋亡的能力,其神经营养活性位于Saposin C的N端氨基酸序列（LIDNNRTEELLY）。Prosaposin、Saposin C以及包含这一功能区域的合成肽,如Prosaptide TX14A都可以与神经细胞膜上百日咳毒素敏感的细胞膜G蛋白偶联受体（GPCR）结合,刺激神经细胞中乙酰胆碱酯酶的活性,促进神经细胞的生长和分化。鞘脂激活蛋白原分布于神经细胞和体液,除了其神经营养活性之外,在外周组织的广泛分布,提示可能还有其它生物活性。2004年Koochekpour S等报道鞘脂激活蛋白原在前列腺癌组织中高表达;并通过化学合成的Saposin C以及Prosaptide/X14A进行研究,发现其可以通过MAPK途径、P13K/Akt途径等信号通路促进前列腺癌细胞的生长、增殖、转移和侵袭,并且抑制癌细胞的凋亡。前列腺癌是死亡率很高的恶性肿瘤,潜伏期长,易复发,且复发后往往转变为雄激素非依赖性前列腺癌（Androgen—independent prostate cancer,AIPC）,临床上缺乏有效的治疗手段。目前发现有多种机制参与AIPC的演变过程,其中雄激素受体（androgen receptor,AR）相关途径的异常活化是AIPC发生发展的主要分子机制。AR作为核转录因子,通过介导雄激素的作用,结合于靶基因的特异元件AREs（androgen receptor elements）后,调节靶基因如前列腺特异抗原（Prostate-specific antigen,PSA）、人腺激肽释放酶2（human glandular kallikrein,hk2）等的表达,从而对前列腺的正常发育、调控其分泌功能发挥重要作用。而AR基因的扩增、突变,AR的辅助激活因子过表达,一些细胞因子、生长因子对AR的激素非依赖性激活,以及雄激素通过非基因组的（nongenomiC）信号途径对AR功能的调节等,使AR在激素非依赖性前列腺癌中持续活化而发挥功能。由于Saposin C以及Prosaptide TX14A能够促进前列腺癌细胞增殖,而AR在前列腺癌细胞的增殖中起重要作用,本研究旨在探讨Saposin C及其功能结构域——鞘脂激活肽NP（Neurotrophic Peptide,NP）对AR表达和功能影响。我们首先构建含有Saposin C或NP与Tat-PTD蛋白转导结构域序列的融合蛋白的真核表达载体及其对照载体。Tat-PTD蛋白转导域具有不依赖ATP和膜通道、高效穿过生物膜的功能,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜运输出入几乎所有的组织和细胞。由于Saposin C为分泌蛋白,并通过膜受体介导其功能,我们在Saposin C/NP前面引入Tat-PTD,使Saposin C能通过Tat-PTD的蛋白转导功能实现跨膜转运并发挥作用。利用脂质体法转染雄激素依赖性前列腺癌细胞（LNCaP）和雄激素非依赖性前列腺癌细胞（PC3、DU145）,通过MTT、RT-PCR、Western Blot、荧光素酶活性分析、免疫荧光技术及免疫共沉淀等方法分析Saposin C/NP对前列腺癌细胞生长的影响以及对AR基因表达和功能的影响。我们的研究结果如下:（1）载体构建:以pcDNA3.1（+）为母载体,构建真核表达载体pcDNA-TAT-NP和pcDNA-NP:以带有myc和His标签的pcDNA3.1/myc-HisB（-）为母载体,插入SaposinC或NP序列分别得到pcDNA-TAT-Saposin C、pcDNA-Saposin C、pcDNA-NP/His的表达载体,测序分析序列正确。RT—PCR以及利用His标签进行Western Blot实验,分别在mRNA和蛋白水平检测所构建载体的表达,结果表明TAT-Saposin C、Saposin C、TAT—NP、NP均能够在前列腺癌细胞中表达;（2）确定Saposin C和NP蛋白在细胞中的定位:免疫荧光技术检测结果表明,TAT-Saposin C定位于细胞内及细胞膜外,而Saposin C和NP只分布于细胞内;（3）确定Saposin C/NP对细胞增殖的影响:流式细胞术结果表明,NP及TAT-NP能够促使细胞进入S和G2/M期:MTT结果表明,TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能刺激激素依赖型及激素非依赖型前列腺癌细胞的增殖;（4）确定Saposin C/NP对AR表达和功能的影响:RT-PCR、Western Blot结果显示,在mRNA和蛋白水平,TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能增加AR基因的表达,并增强AR promoter的表达活性;通过检测PSApromoter、hk2-3ARE报告基因的表达活性,证实TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能够增强AR的转录激活活性,促进AR的靶基因PSA、hk2的表达;（5）确定SaposinC/NP对AR核定位的影响:免疫荧光结果显示,TAT-SaposinC、Saposin C和NP在雄激素缺乏的情况下,能够使AR激活并定位于细胞核;（6）确定SaposinC/NP激活AR可能的机制:AR蛋白的磷酸化是AR活化、定位于细胞核的重要方式,MAPK和P13K/Akt信号途径均是使AR磷酸化的重要途径。由于无TAT蛋白转导结构域的SaposinC和NP定位于细胞内,但仍然能够促进细胞增殖,促进AR的表达、功能以及促进AR的核定位。首先通过采用百日咳毒素封闭细胞膜上的G蛋白受体,发现Saposin C、NP仍能增强AR的转录激活功能,促进PSA promoter和hk2-3ARE的表达活性,说明膜受体可能不参与Saposin C、NP激活AR的过程;采用蛋白酶抑制剂封闭P13K/Akt途径后,并不影响胞内Saposin C对ERK的磷酸化,继而不影响AR的磷酸化活化;采用免疫荧光和免疫共沉淀技术进一步证实Saposin C、NP分别与Src蛋白产生蛋白一蛋白间相互作用,同时促进Src与AR蛋白—蛋白间的相互作用。上述结果提示Saposin C/NP活化AR的过程可能不依赖于细胞膜G蛋白受体,可能通过与Src蛋白相互作用,促进Src与AR的结合进而激活Src活化AR的信号途径,最终使AR磷酸化激活。总之,真核表达载体Saposin C/NP在细胞内的表达能够促进前列腺癌细胞增殖,增强AR的表达和功能,促进AR核定位,其机制可能不依赖于细胞膜上的G蛋白受体途径,而是通过与非受体酪氨酸蛋白激酶Src产生蛋白—蛋白相互作用,活化Src激活AR的信号途径,使AR磷酸化激活,促进下游靶基因的表达,进而促进细胞增殖。另外,我们的实验结果也表明,Saposin C/NP上调AR的作用与雄激素具有协同效应,但雄激素活化AR的作用要强于Saposin C/NP。综上所述,神经营养因子Saposin C可能是在AIPC中促进AR活化的一个新的蛋白因子,其中Saposin C的功能结构域NP可能具有重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 一、雄激素受体的结构
• 二、雄激素受体的功能及其调节
• 三、AR与前列腺癌
• 四、鞘脂激活蛋白原与前列腺癌
• 五、Tat-PTD蛋白转导结构域
• 六、Src非受体酪氨酸激酶
• 第一部分:Saposin C/NP表达载体的构建及其对前列腺癌细胞增殖的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 结论
• 第二部分:Saposin C/NP对前列腺癌细胞雄激素受体AR表达和功能的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 结论
• 第三部分:Saposin C/NP上调AR表达和功能的分子机制研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 结论
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 外文论文