论文摘要
肝细胞癌（以下简称肝癌）是一种高度恶性肿瘤,严重威胁人类健康。至今为止,肝癌发生的分子机制仍不明了。基因启动子区高甲基化异常是肝癌中抑癌基因沉默,肿瘤发生的重要原因之一。为此,我们拟建立肝癌DNA甲基化谱,探索肝癌发生表观遗传学机制,结合肝癌患者临床病理资料探讨肝癌甲基化谱临床意义。本研究收集60例天津地区肝癌、相应癌旁、16例肝炎后肝硬化、5例慢性肝炎和5例正常肝组织,筛选消化道肿瘤中经常甲基化失活的8个肿瘤抑制基因,应用甲基化特异性聚合酶链式反应确定所有标本在上述基因中的甲基化状态,分别建立上述组织DNA甲基化谱。结果显示,上述基因甲基化在肝癌中属高频发事件,该谱系具有中国地域特征和与乙肝相关病因特征。癌组织中RASSF1A（95%）、APC（90%）、GSTP1（73.3%）、p16（65%）、RIZ1（61.6%）和MGMT（60%）等基因甲基化率高于癌旁组织（p＜0.05）,显示这些基因甲基化状态的肿瘤特异性。癌旁组织MGMT（41.6%）、GSTP1（40%）、RIZ1（25%）等基因甲基化率高于肝硬化组织（p＜0.05）,肝癌、癌旁和肝硬化组织中DNA甲基化谱的差异反映了肝癌中渐进的表观遗传学改变,同时也提示,肝脏中GSTP1、RIZ1、MGMT等基因甲基化状态具有风险评估和早期诊断价值。在肝癌甲基化谱与临床病例资料的相关分析中,p16基因甲基化阳性患者平均年龄高于阴性患者,显示p16基因在老化与肿瘤发生中的双重作用。巨块型肝癌中MGMT基因阳性患者比例高于阴性患者,MGMT基因甲基化阳性患者无瘤生存期短于阴性患者,显示了肿瘤中MGMT基因甲基化状态的预后评估价值。区域癌化是一种肿瘤起源理论,它不仅可用于解释肿瘤的多发、复发机制,而且在肿瘤风险评估、预后判断、分子边界和化学预防中具有重要价值,目前该理论已在几乎所有人类组织、器官中得到证实,但肝脏中尚无人报道。我们通过肝癌、癌旁、肝硬化等组织甲基化谱比较发现,癌旁组织中存在具有肝癌特异性而与背景疾病无关的DNA甲基化异常,提示肝脏中区域癌化的存在。进一步我们对比了肝癌与癌旁组织间肝癌特异性基因甲基化谱的一致性,其中39（65%）例患者6基因甲基化状态完全一致,21（35%）例患者存在1-3个基因的不一致,提示肝癌克隆起源的复杂。在癌旁甲基化谱的生存分析中,RIZ1基因甲基化阳性患者无瘤生存期更短,显示癌旁部位区域癌化现象的预后评估价值。进一步分析发现,在复发病例中,无论是癌旁RIZ1基因阳性病例还是小肝癌病例均有非切缘的局部复发趋势,提示基于区域癌化的第二区域肿瘤在肝癌复发中的地位。DNA甲基化异常并不改变核酸序列,因此与基因突变或缺失不同,肿瘤细胞中的DNA甲基化异常是可以逆转的,去甲基化治疗有望成为肿瘤防治的新型有效途径。目前研究较多的去甲基化药物5-氮-2’脱氧胞苷具有非特异的基因组去甲基化作用,可诱导肿瘤细胞分化,但是由于独特的药理特性及潜在的诱发肿瘤风险,目前该药仅用于少数血源性肿瘤的临床治疗,该药物仍需进一步的机制探讨,优化用药方案,拓展抗肿瘤范围。此外,寻找更多低毒高效的去甲基化替代药物也是该领域的热点。中药苦参碱具有多种抗肿瘤机制,可诱导肿瘤细胞分化,抑癌基因表达增强,但是否具有去甲基化作用仍不清楚。为此,我们以5-氮-2’脱氧胞苷和不同浓度苦参碱分别处理肝癌细胞系HepG2,对处理后细胞进行细胞存活率、细胞形态、甲基化谱、基因转录和蛋白表达等检测,探讨两种药物的抗肿瘤机理。结果显示5-氮-2’脱氧胞苷可成功逆转基因组的高甲基化异常,恢复抑癌基因表达,诱导HepG2细胞阻滞于G2/M期,但是5-氮-2’脱氧胞苷同样具有一定的细胞毒性作用,而且其抗肿瘤作用起效慢,作用时间长。苦参碱具有细胞毒性和诱导分化两方面抗肿瘤机制,其中高浓度苦参碱以细胞毒性为主,低浓度苦参碱以诱导分化为主。低浓度苦参碱可以诱导肿瘤细胞周期停滞于G0/G1期,但不能逆转甲基化失活的肿瘤抑制基因,提示其诱导分化作用与去甲基化机制无关。低浓度苦参碱可以诱导p16和p53基因表达增强,且呈浓度依赖性,结合此二基因作用途径与细胞周期改变的一致性,提示这两个基因高表达是苦参碱诱导肿瘤细胞分化的重要机制之一。
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