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冬凌草甲素与肿瘤坏死因子α诱导L929细胞死亡机制的研究

2020-11-23阅读(175)

冬凌草甲素与肿瘤坏死因子α诱导L929细胞死亡机制的研究

论文摘要

本文对人肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导L929细胞死亡的机制进行了较为系统的研究，并对冬凌草甲素（Oridonin）诱导L929细胞死亡的机制进行了较为深入的探讨。同时本文也较为系统的研究了L929细胞对冬凌草甲素产生耐药性的机制。 在TNFα诱导L929细胞死亡实验中，我们首先精制纯化重组人TNFα，然后对L929细胞进行亚克隆并筛选出对TNFα高敏感的L929细胞株。实验结果表明，TNFα在体外能够明显地抑制L929细胞的增殖；形态学和核荧光染色方法观察到，TNFα作用后的细胞表现出部分凋亡特征；乳酸脱氢酶（LDH）活力测定和DNA片段化分析进一步肯定了TNFα主要通过凋亡途径诱导细胞细胞死亡。在某些外界刺激的作用下，caspase能够介导细胞凋亡，但在我们的研究中发现，caspase不仅未介导TNFα诱导的L929细胞凋亡，而且对细胞凋亡具有保护作用。caspase家族和caspase-3和-8的抑制剂均能够增强L929细胞对TNFα的敏感性，但caspase-9的抑制剂对此没有产生影响。在线粒体途径中，TNFα使Bcl-2和Bax蛋白的表达没有发生变化，表明线粒体途径未参与到此过程中。在TNFα诱导L929细胞凋亡过程中，细胞核内的DNA修复酶poly-（ADP-ribose）polymerase（PARP）未被降解。此外，MAPK家族成员中，p38激酶和细胞外信号调节激酶ERK被激活，从而促进细胞发生凋亡。 根据上述研究结果，我们对caspase家族抑制剂z-VAD-fmk增强TNFα对L929细胞细胞毒性的机制进行了探讨。在TNFα存在的条件下，z-VAD-fmk能剂量依赖性的增加细胞的死亡率。LDH活力测定和DNA片段化分析结果表明，z-VAD-fmk既能促进细胞发生凋亡，又能促进细胞发生坏死。线粒体膜通透性的抑制剂cyclosporine A抑制了细胞死亡率的增加，同时在TNFα存在的条件下，z-VAD-fmk使Bax蛋白的表达水平升高，但不影响Bcl-2和cytochrome c的表达。在TNFα存在的条件下，z-VAD-fmk能够引起c-Jun氮末端激酶JNK的激活，而使ERK的活力被抑制，提示JNK激酶的激活促进了细胞的死亡。虽然caspase的活性受到抑制，但z-VAD-fmk和TNFα引起了PARP的降解，提示从线粒体到细胞核内可能存在着一个未知的信号转导通路，引起PARP以caspase非依赖性

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语
  • 第一章 绪论
  • 第一节 抗肿瘤药物研究进展
  • 一 肿瘤的发生与特性
  • 二 抗癌药物开发及其应用
  • 第二节 肿瘤细胞凋亡及其分子机制研究进展
  • 一 细胞凋亡
  • 二 细胞凋亡与肿瘤的关系
  • 三 细胞凋亡的信号转导途径
  • 1、caspase蛋白酶与细胞凋亡
  • 2、死亡受体途径
  • 3、线粒体途径
  • 4、MAPK信号转导途径
  • 5、p53与细胞凋亡
  • 6、PI3K-Akt／PKB通路
  • 7、蛋白激酶C信号转导通路
  • 参考文献
  • 第二章 TNFα诱导L929细胞死亡机制及caspase家族抑制剂z-VAD-fmk增强细胞对TNFα敏感性机制的研究
  • 第一节 TNFα的研究进展
  • 一 TNFα受体的信号传导
  • 二 TNFα的生物学活性
  • 三 TNFα的生物学检测方法
  • 第二节 TNFα诱导L929细胞死亡机制的研究
  • 一 实验部分
  • 1、实验材料
  • 2、实验方法
  • 二 实验结果
  • 1、人重组TNFα的精制及定量
  • 2、L929细胞的亚克隆
  • 3、TNFα在体外对L929细胞的生长抑制作用
  • 4、polymyxin B（PB）对TNFα诱导L929细胞死亡的影响
  • 5、TNFα对L929细胞形态学特征的影响
  • 6、TNFα对L929细胞DNA降解的影响
  • 7、乳酸脱氢酶活力测定
  • 8、caspase家族成员在TNFα诱导L929细胞死亡过程中的作用
  • 9、Bcl-2家族成员对TNFα诱导L929细胞死亡的影响
  • 10、PARP的抑制剂DPQ对TNFα诱导L929细胞死亡的作用
  • 11、MAPK家族成员对TNFα诱导L929细胞死亡的影响
  • 三 讨论
  • 四 结论
  • 第三节 caspase家族抑制剂z-VAD-fmk增强L929细胞对TNFα敏感性机制的研究
  • 一 实验部分
  • 1、实验材料
  • 2、实验方法
  • 二 实验结果
  • 1、caspase家族抑制剂VAD增强TNFα对L929的细胞毒性
  • 2、DNA片段化分析
  • 3、乳酸脱氢酶活力测定
  • 4、VAD通过前线粒体途径增强TNFα对L929的细胞毒性
  • 5、MAPK家族成员对VAD增强TNFα细胞毒性的影响
  • 6、PARP对VAD增强TNFα细胞毒性的影响
  • 三 讨论
  • 四 结论
  • 参考文献
  • 第三章 冬凌草甲素诱导L929细胞死亡机制的研究
  • 第一节 冬凌草甲素的研究进展
  • 一 概述
  • 二 冬凌草甲素的抗肿瘤活性
  • 第二节 冬凌草甲素诱导L929细胞死亡机制的研究
  • 一 实验部分
  • 1、实验材料
  • 2、实验方法
  • 二 实验结果
  • 1、冬凌草甲素在体外对L929细胞的生长抑制作用
  • 2、冬凌草甲素对L929细胞形态学特征的影响
  • 3、冬凌草甲素对L929细胞DNA降解的影响
  • 4、TUNEL法检测冬凌草甲素诱导L929细胞凋亡
  • 5、乳酸脱氢酶活力测定
  • 6、caspase家族成员在冬凌草甲素诱导L929细胞死亡过程中的作用
  • 7、Bcl-2家族成员对冬凌草甲素诱导L929细胞死亡的影响
  • 8、PARP的抑制剂DPQ对TNFα诱导L929细胞死亡的作用
  • 9、PARP的抑制剂DPQ对TNFα诱导L929细胞死亡的作用
  • 10、冬凌草甲素对细胞内源性TNFα表达的影响
  • 三 讨论
  • 四 结论
  • 参考文献
  • 第四章 L929细胞对冬凌草甲素耐药性机制的研究
  • 第一节 肿瘤细胞耐药性机制研究进展
  • 一 耐药性产生的机制
  • 第二节 L929细胞对冬凌草甲素耐药性机制的研究
  • 一 实验部分
  • 1、实验材料
  • 2、实验方法
  • 二 实验结果
  • 1、冬凌草甲素敏感性和耐药性L929细胞的细胞周期分布
  • 2、冬凌草甲素在体外对敏感性和耐药性L929细胞的生长抑制作用
  • 3、冬凌草甲素诱导敏感性和耐药性L929细胞发生凋亡
  • 4、在耐药性的L929细胞中Bcl-2／Bax的表达比率增加
  • 5、MAPK对L929细胞耐药性产生的影响
  • 6、在耐药性的L929细胞中p38激酶活力增高引起Bcl-2蛋白表达增加
  • 7、p53对细胞耐药性产生的影响
  • 8、在耐药性的L929细胞中Bcl-2／Bax蛋白表达比率的增高抑制了PARP的降解但不影响caspase对细胞的保护作用
  • 9、在耐药性和敏感性L929细胞中AIF介导了冬凌草甲素诱导凋亡
  • 三 讨论
  • 四 结论
  • 参考文献
  • 第五章 FGF-2保护冬凌草甲素诱导L929细胞凋亡机制的研究
  • 第一节 FGF-2的研究进展
  • 一 FGF的生物学功能
  • 二 FGF促进癌细胞耐药性的产生
  • 第二节 FGF-2保护冬凌草甲素诱导L929细胞凋亡机制的研究
  • 一 实验部分
  • 1、实验材料
  • 2、实验方法
  • 二 实验结果
  • 1、冬凌草甲素在体外对L929细胞的生长抑制作用
  • 2、冬凌草甲素诱导L929细胞发生凋亡
  • 3、FGF-2逆转了冬凌草甲素诱导的L929细胞凋亡
  • 4、在FGF-2逆转冬凌草甲素诱导L929细胞凋亡的过程中PI3K／PKB信号转导途径未被激活
  • 5、ERK对FGF-2逆转冬凌草甲素诱导L929细胞凋亡的影响
  • 6、Ras和Raf对FGF-2逆转冬凌草甲素诱导L929细胞凋亡的影响
  • 7、Bcl-2／Bax表达比率变化对FGF-2逆转冬凌草甲素诱导L929细胞凋亡的影响
  • 三 讨论
  • 四 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

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