人乳铁蛋白、胸腺肽融合基因在毕赤酵母与生菜中表达的研究

论文摘要

人乳铁蛋白（human Lactoferrin, hLf）是具有多种生物学活性的一种铁结合性糖蛋白, 广泛存在于哺乳动物的乳汁、唾液、眼泪等分泌物中。人乳铁蛋白基因的开放阅读框为2.14kb,蛋白分子量约为80kD 左右。胸腺肽α1（Thymosin alpha 1,Tα1）是一种广泛分布于哺乳动物的各个组织器官中的活性肽,含28 个氨基酸残基,分子量3.108kD,等电点pH=4.2。由于这两个蛋白在人体免疫调节、抗癌和抗病毒等方面具有重要的作用,所以关于他们的研究越来越受到人们的重视。在进行本论文的工作中首先人工合成人乳铁蛋白基因的开放阅读框,并且与本实验室保存的胸腺肽基因融合,然后对融合基因的酵母和生菜表达系统进行了初步的研究。在融合基因表达系统的研究过程中为了提高融合基因的表达量,又引入了透明颤菌血红蛋白基因（Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb）进行了研究。在融合基因的研制中:依据已经公布的人乳铁蛋白基因序列并同时考虑到可实现分别克隆拼接的酶切位点,设计并合成51 个相互重叠的寡核苷酸单链,分9 组退火形成7个基因片段和两个Linker。然后通过克隆、拼接将7 个基因片段合成完整的人乳铁蛋白基因并与胸腺肽基因（100bp 左右）融合,成功的合成了人乳铁蛋白、胸腺肽融合基因（Tα1hLf）。通过测序证明了合成的约2.3kb 的融合基因序列正确,阅读框未发生改变。在毕赤酵母表达融合基因实验中:利用毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建可以在胞内表达vgb 和胞外分泌表达融合基因的载体pPIC9K-vgbTα1hLf。转化酵母后,通过PCR、SDS-PAGE 检测证实融合基因已经整合于酵母基因组并且表达出约83kD 左右的融合蛋白。Western blotting 和抑菌实验表明分泌表达的融合蛋白中人乳铁蛋白具有天然蛋白的活性,从而验证了合成的乳铁蛋白基因和融合基因的正确性。差示光谱分析和贫氧实验表明VHb 具有活性并在贫氧环境中可以促进毕赤酵母的生长和融合蛋白的表达。摇瓶表达实验表明融合蛋白的表达量可以达到30mg/L。在生菜表达融合基因实验中:用pGΩ4A 构建了两种分别由RuBP 启动子和35S 启动子启动融合基因的中间载体,然后将融合基因表达盒与VHb 基因表达盒反向串联并克隆于pBI121 构建出植物表达载体pGBIVHbTα1hL（fvgb 和融合基因均由35S 启动子启动）和pGBIRVHbTα1hLf（vgb 由35S 启动子启动,融合基因由RuBP 启动子启动）,利用农杆菌介导法将两种植物表达载体转化生菜并获得46株再生苗。对再生苗进行PCR 检测和用乳铁蛋白抗体ELISA 检测,结果表明融合蛋白已经获得表达。差示光谱分析表明vgb 基因也已经表达且具有活性。

论文目录

• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1 乳铁蛋白研究进展
• 1.1 乳铁蛋白的分布与结构
• 1.1.1 乳铁蛋白的分布
• 1.1.2 乳铁蛋白的结构
• 1.2 乳铁蛋白的一级结构保守性与功能关系
• 1.3 乳铁蛋白的生物学功能
• 1.3.1 抑菌和杀菌作用
• 1.3.2 抗病毒作用
• 1.3.3 参与机体免疫调节
• 3+的吸收避免刺激肠胃'>1.3.4 促进机体对Fe³+的吸收避免刺激肠胃
• 1.3.5 乳铁蛋白参与基因转录调节
• 1.3.6 阻断脂肪氧化
• 1.3.7 促进肠道内有益微生物的生长,调整肠道菌群
• 1.3.8 抗癌作用
• 1.4 乳铁蛋白的应用
• 2 胸腺肽α1研究进展
• 2.1 Tα1 的分布
• 2.2 Tα1 的理化特点
• 2.3 Tα1 的生物学功能
• 2.4 Tα1 的应用
• 3 人乳铁蛋白与胸腺肽的异源表达系统的进展
• 3.1 乳铁蛋白异源表达系统的研究
• 3.1.1 微生物发酵或动物细胞组织培养
• 3.1.2 转基因植物表达系统
• 3.1.3 转基因动物乳腺表达系统
• 3.2 胸腺肽α1 异源表达系统研究进展
• 4 透明颤菌血红蛋白研究进展
• 4.1 VHb 结构
• 4.2 VHb 的生理特点及生理功能
• 4.3 VHb 的作用机理
• 4.4 VHb 的应用
• 4.4.1 VHb 与微生物基因工程
• 4.4.2 VHb 与植物基因工程
• 5 研究目的与意义
• 第二章 人乳铁蛋白基因合成及人乳铁蛋白胸腺肽融合基因的研制
• 1 实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 有关的质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 人工合成的寡核苷酸片段
• 1.5 培养基
• 1.6 Tα1hLf 融合基因PCR 引物
• 2 方法
• 2.1 质粒DNA的小量提取
• 2.2 质粒 DNA 的大量制备
• 2.3 DNA的限制性酶切反应
• 2.4 目的DNA 片段的电泳回收
• 2.5 融合基因的PCR 扩增
• 2.6 载体与DNA 的连接反应
• 2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.8 质粒DNA 转化大肠杆菌
• 3 结果与分析
• 3.1 人乳铁蛋白基因的分子设计
• 3.2 人乳铁蛋白基因的合成
• 3.3 人乳铁蛋白基因hLf 与胸腺肽基因T-α1 的融合
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 Tα1hLf 和vgb 在毕赤酵母中表达
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 本研究中应用的主要质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 试剂及仪器
• 1.5 PCR 引物
• 2 方法
• 2.1 质粒 DNA 的小量提取
• 2.2 质粒DNA 的大量制备
• 2.3 DNA 的限制性酶切反应
• 2.4 目的DNA 片段的电泳回收
• 2.5 粘端连接
• 2.6 基因的 PCR 扩增
• 2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.8 质粒DNA 转化大肠杆菌
• 2.9 蛋白质的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.10 Western bolt 鉴定
• 2.11 毕赤酵母感受态细胞的制备
• 2.12 酵母的电击转化及重组子的初筛
• 2.13 酵母重组子甲醇利用型的确定
• 2.14 分泌型转化子的筛选
• 2.15 酵母总DNA 的提取
• 2.16 酵母胞内蛋白的检测
• 2.17 转化子的摇瓶表达研究
• 2.18 融合蛋白中乳铁蛋白抑菌活性检测
• 2.19 VHb 的定性方法
• 2.20 不同供氧条件下胞内表达的VHb 对毕赤酵母生长的影响
• 2.21 菌密度的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 表达载体构建
• 3.2 表达载体的鉴定
• 3.3 重组载体转化毕赤酵母及重组酵母的筛选
• 3.4 分泌型转化子的筛选
• 3.5 重组子的PCR 检测
• 3.6 SDS-PAGE 蛋白检测
• 3.7 利用人乳铁蛋白抗原 Western Blotting 检测融合蛋白
• 3.8 表达产物的生物活性检测
• 3.8.1 VHb 的活性检测
• 3.8.2 融合基因中人乳铁蛋白的抑菌活性检测
• 3.9 贫氧条件对酵母菌体生长影响的研究
• 3.10 酵母转化子的摇瓶诱导表达分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 Tα1hLf 和vgb 基因在生菜中表达
• 1 材料
• 1.1 菌株与植物材料
• 1.2 有关的质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 试剂及仪器
• 2 方法
• 2.1 质粒DNA 的小量提取
• 2.2 质粒DNA 的大量制备
• 2.3 DNA 的限制性酶切反应
• 2.4 目的DNA 片段的电泳回收
• 2.5 粘端连接
• 2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.7 质粒DNA 转化大肠杆菌
• 2.8 蛋白质的SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.9 根瘤农杆菌感受态细胞的制备
• 2.10 表达载体转化根癌农杆菌
• 2.11 生菜无菌苗的培养
• 2.12 农杆菌介导的叶盘法转化生菜
• 2.13 Kan 抗性植株的筛选
• 2.14 再生苗诱导生根
• 2.15 无菌苗的移栽
• 2.16 生菜基因组DNA 的提取
• 2.17 转基因植株的PCR 检测
• 2.18 生菜总蛋白提取
• 2.19 ELISA 检测融合蛋白中人乳铁蛋白的表达
• 2.20 生菜表达的 VHb 蛋白差示光谱检测
• 3 结果分析
• 3.1 融合基因植物表达表达载体构建
• 3.1.1 将Tα1hLf 克隆进中间载体
• 3.1.2 构建双表达盒中间载
• 3.1.3 双表达盒植物表达载体构建
• 3.2 表达载体鉴定
• 3.3 表达载体转化农杆菌
• 3.4 农杆菌介导转化生菜
• 3.5 PCR 检测再生苗
• 3.6 ELASA 分析转基因苗中融合蛋白表达情况
• 3.7 差示光谱分析VHb 蛋白
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介