论文摘要
背景老龄化是包括我国在内的许多国家的严重的社会与卫生问题。我国是一个人口大国,人口老年化的速度会更快,现在我国60岁以上人口已经超过10%,因而患痴呆的人数将有显著增加,特别是在较高龄人口中该病的患病率会成倍增长。Alzheimer病（Alzheimer’s disease,AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病,约占痴呆症的60%,临床上以与学习记忆相关脑区β—淀粉样蛋白沉淀形成的老年斑（senile plaque,SP）和tau蛋白异常磷酸化形成的神经元纤维缠结（neurofillary tangles,NFT）为其病理学特征,并伴随有大量神经元的丢失,表现为认知功能的进行性减退,或伴有人格和情感控制等方面的异常以及日常生活能力的下降。AD目前已经成为严重危害老年人健康的主要疾病,其死亡率仅次于心血管疾病、癌症和脑卒中。流行病学调查显示老年女性AD的患病率显著高于男性,为男性患者的1.5-3倍,提示雌激素的缺乏与AD的发生和发展有关联,女性绝经后内源性雌激素水平下降,增加了AD的发病风险。因此,绝经后老年性痴呆已成为AD中最主要的类型。雌激素替代治疗（Estrogen replacementtherapy,ERT）可以改善认知功能。这为AD的预防和治疗提供了新的线索和研究方向。目前研究较多的有:增强胆碱能系统功能、易化突触可塑性和突触传递、抗神经细胞凋亡作用、炎症等。然而,ERT可能会给受治者带来无法预料的激素类副作用,这是目前制约ERT在临床上应用的一个主要原因。因此,具有雌激素样作用的中药单药或者复方的研究受到了越来越多的关注。目的本实验研究使用去卵巢大鼠建立低雌激素记忆障碍模型,探讨不忘散改善绝经后妇女认知功能的机制,为临床相关疾病的治疗提供科学依据。方法1.研究对象:去卵巢大鼠随机分成4组。实验动物共5组:（1）假手术组（SHAM）:16只;（2）去卵巢组（OVX）:16只;（3）17β—雌二醇组（E2）:OVX+E2,16只;（4）中药不忘散高剂量组（BH）:OVX+不忘散高剂量,16只;（5）中药不忘散低剂量组（BL）:OVX+不忘散低剂量,16只。E2组给予17β—雌二醇100μg/（kg·d）,BH组给予不忘散1.2g/（kg·d）,BL组给予不忘散0.6g/（kg·d）,SHAM组和OVX组分别给予等量蒸馏水。每组大鼠均灌胃给药,连续给药12周后开始后续实验。2.研究内容:（1）Morris水迷宫检测学习记忆能力;（2）血清雌二醇的测定;（3）观察海马亚区细胞形态学和超微结构的变化;（4）免疫组化染色检测海马ChAT、突触素P38、Bcl—2、Bax阳性细胞的表达;（5）实时定量RT—PCR法检测海马ChAT、突触素P38、Bcl-2、Bax、GFAP、Arom mRNA表达;（6）免疫印记（Western blot）检测海马GFAP、Arom蛋白表达。结果1.各组大鼠Morris水迷宫测试结果:OVX组潜伏期和距离较SHAM组明显延长（P＜0.01）,E2组和中药高剂量组可以显著缩短潜伏期和游泳距离,和SHAM组水平相当,低剂量组较高剂量差。同组大鼠,随着训练时段的增加,去卵巢组没有明显改变（P＞0.05）,BH组的潜伏期和游泳距离越来越短（P＜0.01）。游泳速度可见,各组大鼠没有明显差异。可以排除因个体差异引起的不同。记忆保留实验显示,原站台所在象限的平均停留时间和穿越站台次数OVX组明显低于SHAM组（P＜0.01）,而E2组和中药治疗组可以改善去卵巢造成的降低,和SHAM组没有明显差异（P＞0.05）,中药高剂量组比OVX组在原站台所在象限的平均停留时间和穿越站台次数增高,有明显差异（P＜0.05）。2.血清雌二醇的浓度比较:OVX组与SHAM组和E2组比较,大鼠血清雌激素的含量明显降低（P＜0.01）。BH组和BL组大鼠血清中雌激素水平显著提高（P＜0.01）。BH组和BL组与SHAM组比较,血清中雌激素的含量差异无显著性（P＞0.05）。3.组织切片光镜下HE染色观察:各组大鼠海马锥体细胞数量众多,细胞排列紧密整齐,细胞轮廓清晰,细胞与周围组织分界清晰,胞核为蓝色,胞浆淡红色,各组神经细胞在细胞形态、大小和排列上未见明显差别。4.透射电镜观察海马CA1区锥体细胞超微结构:OVX组海马CA1区锥体细胞,细胞呈较高电子密度、不规则,核形及染色质异常,线粒体结构模糊,内质网肿胀,细胞膜上突触连接结构少。这些现象可以初步判断锥体细胞出现凋亡。SHAM组锥体细胞细胞核椭圆形,核仁居中,染色质正常,多数线粒体结构正常,内质网短、少、没有扩张,细胞膜上分布有连接结构。BH组、BL组、E2组染色质正常,多数线粒体结构正常,细胞膜上分布有连接结构。5.突触密度检测:大脑皮质内神经元的轴突、树突和胶质细胞的突起相互交织连接所形成的复杂网络结构成为神经毡。结果OVX组神经毡内的突触数密度较SHAM组和E2组明显降低（P＜0.01）。BH组突触数密度较OVX组明显增加（P＜0.01）,和SHAM组无显著性差异（P＞0.05）;BL组较OVX组突触密度也有增加,但无统计学意义6.免疫组化染色检测各组大鼠海马ChAT、突触素P38、Bcl—2、Bax阳性细胞的表达。（1）图像分析结果显示,SHAM组、E2组、BH组海马CA1区胆碱能神经元的光密度值均高于OVX组,且有统计学意义（P＜0.01或0.05）;BL组海马CA1区胆碱能神经元的光密度值高于OVX组,但无统计学意义（P＞0.05）。BH组、BL组与SHAM组比较没有显著性差异（P＞0.05）。（2）图像分析结果显示,SHAM组、E2组、BH组海马CA1区突触素P38的光密度值均较OVX组有显著性增高（P＜0.01或0.05）,BL组突触素P38的光密度值也有增高,但没有统计学意义。SHAM组P38光密度值与E2组、BH组、BL组比较没有显著性差异（P＞0.05）。（3）图像分析结果显示,OVX组Bcl—2阳性细胞光密度值较SHAM组明显降低（P＜0.01）,而E2组、BH组、BL组阻止了Bcl—2阳性细胞光密度值的降低,与OVX组比较有显著性提高（P＜0.01或0.05）,与SHAM组比较没有显著性差异（P＞0.05）。（4）图像分析显示,OVX组Bax阳性细胞表达率显著增高,其光密度值与SHAM组Bax阳性细胞表达的光密度值比较有显著性差异（P＜0.01）,而E2组、BH组、BL组较OVX组Bax阳性细胞表达减少,且有显著性差异（P＜0.01或0.05）,而E2组、BH组、BL组与SHAM组比较没有统计学意义（P＞0.05）。7.TUNEL染色检测凋亡率的比较:从凋亡细胞百分率可见,OVX组凋亡神经元百分率较SHAM组明显增加（P＜0.01）,E2组、BH组、BL组凋亡神经元百分率明显降低,与OVX组比较有显著性意义（P＜0.01）:E2组、BH组、BL组凋亡神经元百分率较SHAM组高,但无统计学意义（P＞0.05）。8.实时定量RT-PCR检测大鼠海马ChAT、突触素P38、Bcl-2、Bax、Arom、GFAP mRNA的表达水平。（1）ChAT mRNA表达比较:与OVX组比较,E2组、BH组ChAT mRNA表达明显增高（P＜0.01）,BL组ChAT mRNA表达也有所增高,但无统计学意义（P＞0.05）。E2组和BH组与SHAM组比较没有显著性差异（P＞0.05）。（2）突触素P38 mRNA表达比较:与OVX组比较,E2组、BH组P38 mRNA的表达明显增加（P＜0.01或0.05）,BL组P38 mRNA的表达也有增加,但没有统计学意义（P＞0.05）,SHAM组与E2组、BH组、BL组比较,P38 mRNA的表达无显著性差异（P＞0.05）。（3）Bcl-2 mRNA表达比较:与SHAM组比较,OVX组Bcl-2 mRNA的表达明显降低（P＜0.01）,E2组Bcl-2 mRNA的表达较OVX组显著升高（P＜0.05）,BH组与E2组比较没有显著性差异（P＞0.05）,BL组Bcl-2 mRNA的表达较OVX组升高,但无统计学意义（P＞0.05）。（4）Bax mRNA表达比较:与SHAM组比较,OVX组Bax mRNA的表达明显升高（P＜0.01）,E2组Bax mRNA的表达较OVX组显著降低（P＜0.05）,BH组、BL组与E2组比较没有显著性差异（P＞0.05）。（5）Arom mRNA表达比较:OVX组Arom mRNA的表达较SHAM组明显升高（P＜0.01）,而BH组Arom mRNA的表达较OVX组明显降低（P＜0.01）,BH组、E2组、BL组与SHAM组比较没有显著性差异（P＞0.05）。（6）GFAP mRNA表达比较:OVX组GFAP mRNA的表达较SHAM组增高,且有显著性意义（P＜0.01）,E2组、BH组、BL组GFAP mRNA的表达与OVX组比较明显降低（P＜0.01）。E2组、BH组、BL组GFAP mRNA的表达较SHAM组没有显著性差异（P＞0.05）。9.Western blot检测大鼠海马Arom、GFAP蛋白表达水平。（1）Arom蛋白表达比较:OVX组Arom蛋白表达与SHAM组比较显著提高（P＜0.01）。与OVX组比较,BH组、E2组、BL组Arom蛋白表达明显降低（P＜0.01）,其中BH组降低幅度最大;BH组、E2组、BL组Arom蛋白表达与SHAM组比较,没有显著性差异（P＞0.05）。（2）GFAP蛋白表达比较:OVX组GFAP蛋白的表达较SHAM组增高,且有显著性意义（P＜0.01）,E2组、BH组、BL组GFAP蛋白的表达较OVX组明显降低（P＜0.01）,与SHAM组比较没有显著性差异（P＞0.05）。结论1.不忘散对OVX大鼠显著的益智作用,其益智机制可能与不忘散升高OVX大鼠血清雌二醇水平,保护海马CA1区锥体细胞线粒体功能有关。2.雌激素缺乏导致了大鼠海马结构胆碱能神经元内ChAT表达的下降,胆碱能神经元内ChAT数量的下降可能是导致去卵巢大鼠记忆力下降的原因之一。不忘散有助于胆碱能神经元的生长和存活。3.不忘散可以增加OVX大鼠海马结构内的突触密度,突触素P38的表达明显增加,两者的结果一致,共同反映了突触可塑性的提高,这可能是不忘散益智的另一原因。4.OVX大鼠海马结构内凋亡抑制因子Bcl—2表达降低,凋亡促进因子Bax表达升高,趋于凋亡的细胞增加,可能是去卵巢大鼠行为学异常的原因之一。不忘散可以逆转两者的表达,使细胞趋于存活。5.不忘散改善学习记忆障碍可能与维持星形胶质细胞的稳定,减少芳香化酶的表达,降低炎性反应有关。
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