斑马鱼分拣蛋白SNX10基因功能研究

论文摘要

SNXs(sorting nexins)是近年开始研究的一个基因家族,以包含PX(Phoxhomology)结构域、定位于早期内涵体、参与细胞内蛋白分拣为特征。从真菌酵母到人类广泛表达,己知部分SNXs参与EGFR(epidermal growth factor receptor)内吞分拣,大多数家族成员功能尚未报道。文献报道人和鼠类SNX10在多种细胞系中诱导成泡,个体水平的生理功能未有研究。本文以斑马鱼为模型,研究斑马鱼dSNX10a和dSNX10b在斑马鱼早期胚胎发育过程中的生理功能,利用细胞转染、原位杂交、基因敲低等技术,证实斑马鱼dSNX10a是人类hSNX10的同源蛋白,参与斑马鱼早期左右不对称发育;dSNX10b是鱼类特有基因,参与心脏发育。斑马鱼dSNX10a和dSNX10b的氨基酸序列有61%的同源性,都定位于早期内涵体,却有着截然不同的细胞和生理水平的生物功能。研究结果将为进一步探讨两者分子结构与生物功能的关系奠定基础,也为研究SNXs家族基因功能提供了一种新的方法。

论文目录

• 图表清单
• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 磷脂酰肌醇的分子结构及与之相互作用的蛋白结构域
• 1.2 PX结构域和SNXs蛋白家族
• 1.3 内涵体细胞器和蛋白分拣
• 1.4 SNX10及其在细胞水平的功能
• 1.5 个体水平的基因敲低和过表达技术
• 1.6 个体水平的原位杂交技术
• 1.7 模式生物斑马鱼
• 1.8 左右不对称发育
• 1.9 心脏的发育
• 1.10 拟解决的问题
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 动物材料
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 细胞系
• 2.1.4 酶及试剂盒、载体等
• 1) 酶
• 2) Marker及核酸染料
• 3) 试剂盒及引物
• 4) 克隆载体
• 2.1.5 细胞培养基及转染试剂
• 2.1.6 原位杂交相关试剂
• 2.1.7 morpholino寡核苷酸
• 2.1.8 主要溶液
• 1) 免疫荧光
• 2) 原位杂交
• 2.1.9 主要仪器
• 2.1.10 常用相关软件及网站
• 2.2 方法
• 2.2.1 动物材料的处理
• 2.2.2 总RNA提取、反转录和检测
• 1) RNA提取
• 2) 反转录
• 3) cDNA质量检测
• 2.2.3 目的基因的RT-PCR
• 1) RT-PCR
• 2) 目的片段回收、连接、转化
• 3) 克隆的鉴定和测序
• 2.2.4 细胞转染及免疫荧光
• 1) MCF7细胞系的培养
• 2) MCF7细胞系的转染
• 3) 免疫荧光
• 2.2.5 斑马鱼养殖
• 2.2.6 显微注射及morpholino基因敲低技术
• 2.2.7 原位杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA提取
• 3.2 各基因cDNA全长的克隆
• 3.3 dSNX10a的序列与NCBI公布的SNX10序列差别
• 3.4 转染细胞鉴定dSNX10a/dSNX10b/xSNX10
• 3.5 免疫荧光鉴定dSNX10a/dSNX10b细胞器定位结果
• 3.6 斑马鱼dSNX10a/dSNX10b原位杂交结果和dSNX10a/dSNX10b基因表达敲低后个体表型
• 3.7 小结和讨论
• 3.7.1 小结
• 3.7.2 讨论
• 参考文献
• 致谢