不同倍性虹鳟Oncorhynchus mykiss性腺和配子发育及血细胞比较研究

论文摘要

虹鳟Onchorynchus mykiss（Walbaum）是重要的冷水性养殖鱼类。为提高产品的质量和群体产量,近年来养殖人工诱导三倍体不育系虹鳟已成为一种发展趋势。四倍体虹鳟作为三倍体制种的亲本,也已被成功诱导和培育。由于染色体多倍化,多倍体虹鳟的生殖机制发生了改变,甚至导致了三倍体虹鳟雌性不育。性腺是鱼类进行繁殖活动的基础,只有充分了解性腺发育和配子发生的规律,才能对鱼类的繁殖过程更好地进行调控。尽管有关三倍体虹鳟性腺发育已有一些研究,但缺乏对其整个发育过程的组织学、细胞学、生殖内分泌学等的系统研究,尤其缺乏对早期性腺发育的了解,对三倍体虹鳟卵巢败育的起始变化过程没有描述,对卵母细胞败育的起始时间也各有不同的观点,更缺乏对性腺中非生殖细胞发育变化及其作用的研究,对三倍体虹鳟的生殖机制也有各自不同的解释。有关四倍体虹鳟的性腺发育研究尚未见报道。本研究以435月龄的二倍体和三倍体虹鳟以及26月龄、35月龄的四倍体虹鳟为试验材料,采用比较解剖技术、光学显微技术、透射电镜技术、放射免疫和免疫组化等技术,从性腺解剖结构、组织结构、超微结构以及生殖激素含量变化等几方面,对二倍体、三倍体和四倍体虹鳟进行了比较研究,并对二倍体和三倍体虹鳟的卵黄蛋白原进行了免疫组化定位,以了解染色体多倍化对多倍体虹鳟性腺发育和配子发生的影响,探讨多倍体虹鳟的生殖机制。此外,对不同倍性虹鳟的血细胞特征进行了研究。试验结果表明:1.二倍体雌性虹鳟35月龄卵巢已接近成熟,多数样本卵巢发育至IV+++期并排卵;雄鱼26月龄基本成熟,绝大多数样本精巢进入V期（排精期）。性成熟前雌雄虹鳟性体指数GSI持续上升,产前达峰值;雌性虹鳟肝体指数HSI在卵巢发育中后期显著下降,与GSI变化呈负相关。2.三倍体卵巢形态发育异常,不能成熟。I期卵巢与二倍体没有区别,在II期（8月龄）后发育停滞,始终保持前部稍膨大而后部呈线状的形态,没有可见的卵母细胞。个别样本卵巢中有极少数正常发育的卵母细胞。GSI始终维持在较低水平,低于同期二倍体。HSI也低于同期二倍体,与GSI没有明显的相关性;三倍体精巢形态发育基本正常,与二倍体比较发育滞后,35月龄只有少数个体成熟进入V期。GSI低于二倍体。3.四倍体雌、雄虹鳟性腺均能正常发育,形态与二倍体相似,性成熟稍晚于二倍体。35月龄仅有少数个体卵巢进入IV+++期,绝大多数样本卵巢仍处于未排卵的IV++期;26月龄仅有少数样本精巢发育成熟（V期）;GSI与二倍体无显著差异。4.二倍体虹鳟卵黄发生早期的卵母细胞卵黄核呈条块状,然后迁移至皮质区形成外周环,超微结构显示,卵黄核由高尔基体和线粒体组成,为内源性卵黄的来源。生长环即将消失时,卵母细胞胞质中部出现一种嗜碱性丝状环,并消失于III时相。5.三倍体虹鳟卵巢发育阻滞,经历了卵原细胞→卵黄发育前期卵母细胞→败育卵母细胞+卵原细胞簇→卵原细胞簇+类生精细胞囊→类生精细胞囊的过程。染色体三倍化对雌鱼的影响主要发生在卵巢发育早期,发育中后期卵巢有雄性化趋势。在性腺分化期,雌性三倍体虹鳟卵巢发育与同期二倍体没有区别,卵母细胞败育发生在第一次减数分裂的双线期（核仁外周晚期、卵黄发生前期）,而不是其他学者报道的偶线期到粗线期。三倍体虹鳟雌性不育是综合因素所致:卵母细胞在第一次减数分裂的双线期败育是由于已配对的染色体分离紊乱;此后,卵巢中的卵原细胞不能进一步发育,是因为被卵原细胞簇壁的基质细胞阻隔,缺乏与滤泡细胞的互作而不能进一步分化。游离于卵原细胞簇外的卵原细胞可正常发育至成熟。6.三倍体雄性虹鳟能够完成精子发生过程,较同期二倍体精巢发育迟缓、坏死细胞多、精子大且大小不等。染色体三倍化对雄鱼的影响主要发生在精子发生的晚期（精子变态期）。7.三倍体虹鳟精巢和卵巢发育中败育的生殖细胞主要被支持细胞（雄性）、类支持细胞（雌性）和成纤维细胞所吞噬。8.四倍体虹鳟卵巢和卵母细胞能够正常发育成熟;精子发生过程与二倍体基本相同,稍有滞后。其精子头部直径为2.82±0.33μm,体积明显大于三倍体（2.37±0.12μm）和二倍体（1.86±0.12μm）。9.二倍体雌性虹鳟未成熟期血清中GtH-Ⅰ和17β-E2持续升高,临近性成熟前GtH-Ⅰ和17β-E2下降。GtH-Ⅱ和T在发育前期含量很低,持续缓慢上升,在临近性成熟前迅速增加。表明GtH-Ⅰ通过刺激性腺产生17β-E2,促进卵母细胞的发育,而GTH-Ⅱ则促进卵子的成熟;三倍体雌性虹鳟生殖激素的变化与二倍体有明显不同,血清中GtH-Ⅰ、GtH-Ⅱ和17β-E2始终在低水平波动,没有明显变化规律。T含量在21月龄后持续上升,显著高于同期二倍体,为三倍体虹鳟卵巢发育类雄性化提供了生理学证据;四倍体雌性虹鳟血清中GtH-Ⅰ、GtH-Ⅱ、17β-E2和T含量与二倍体呈现相同的变化规律。10.二倍体雄性虹鳟未成熟期血清中GtH-Ⅰ和17β-E2持续升高,临近性成熟前GtH-Ⅰ和17β-E2下降。GtH-Ⅱ和T在发育前期含量很低,持续缓慢上升,在临近性成熟前迅速增加。1135月龄雄性个体呈现了2个周期性变化;三倍体雄性虹鳟血清中GtH-Ⅰ、GtH-Ⅱ、17β-E2和T含量与二倍体有相同的变化规律,其变化较同期二倍体滞后,只有1个变化周期;四倍体雄性虹鳟血清中GtH-Ⅰ、GtH-Ⅱ、17β-E2和T含量与二倍体呈现相同的变化规律。11.采用饱和硫酸铵分步沉淀与凝胶色谱两步层析法,从虹鳟卵粗提液中分离、纯化的蛋白为含糖、磷和脂的卵黄脂磷蛋白,分子量为123.2kDa。其抗血清在无外源诱导物诱导的情况下,只与正常雌鱼血浆中的卵黄蛋白原Vg反应,为雌性特异性蛋白。12.免疫组化组织定位显示,二倍体雌性虹鳟卵巢发育至IIIV期,肝细胞和血液中存在Vg,卵巢阳性反应滞后,IVV期卵母细胞中出现Vg。其它生长期,二倍体雌性虹鳟肝细胞和血液Vg呈阴性反应;各发育期三倍体雌性虹鳟,肝脏、血液及性腺Vg呈阴性反应;各发育期雄性二倍体和三倍体虹鳟,肝脏、血液及性腺Vg均呈阴性反应,表明环境中不存在诱导卵黄蛋白原非正常表达的诱导因子;各发育期雌、雄二倍体和三倍体虹鳟肠组织Vg均呈阴性反应,表明Vg的形成与肠道无关。13.三倍体和四倍体虹鳟红细胞比二倍体更大、更长。三倍体和四倍体虹鳟红细胞大小分别为17.35±1.59×10.52±0.70μm和18.66±2.28×11.08±1.47μm ,均大于二倍体（13.30±1.31×8.34±0.63μm）,与二倍体红细胞体积之比及核体积之比预期理论值（1.5︰1、2.0︰1）无显著差异;红细胞短径/长径比值分别为0.60、0.59,小于二倍体（0.63）。三倍体虹鳟红细胞压积明显小于二倍体,是由于三倍体虹鳟单位体积的红细胞数量比二倍体少所致;三倍体虹鳟的红细胞脆性小于二倍体;三倍体虹鳟与二倍体虹鳟的单位体积血液血红蛋白量没有显著差异。14.多倍体虹鳟血液中有一定比例的红细胞核呈哑铃型或双核型。低渗试验显示为红细胞异常分裂,表明多倍体虹鳟的外周血液中红细胞不是终端分化细胞,具有分裂能力。双核型红细胞是核先于质分裂,哑铃型红细胞核是核质同步分裂的中间过程。15.三倍体虹鳟血细胞的发育经历了原始、幼稚和成熟三个阶段。外周血液红细胞系、单核细胞系、淋巴细胞系和粒细胞系中未成熟血细胞的比例分别为13.8%±1.24%、4.14%±0.99%、5.52%±0.58%和3.96%±0.47%,明显高于造血器官的相应指数。外周血液中红细胞的异常分裂是其幼稚红细胞数量增多的主要原因。16.在头肾所产生的血细胞中红细胞比例为66.90%±3.85%,高于脾脏和肝脏的相应指数（56.90%±1.77%、47.20%±2.14%）;在肝脏所产生的血细胞中单核细胞和粒细胞比例分别为21.80%±1.58%和4.92%±0.01%,高于脾脏和头肾的相应指数（17.80%±2.34%、4.87%±0.99%;6.82%±1.24%、3.11%±1.10%）;在肝脏所产生的血细胞中淋巴细胞的比例为14.90%±1.29%,高于头肾和脾脏的相应指数（13.20±2.86%、12.60%±2.74%）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 天然多倍体鱼类
• 1.2 鱼类多倍体的人工诱导
• 1.2.1 人工多倍体产生的生物学原理
• 1.2.2 人工诱导多倍体鱼类的方法
• 1.2.3 倍性鉴定
• 1.2.4 三倍体鱼类育种的意义
• 1.3 鱼类多倍体育种的研究进展
• 1.3.1 鲑科鱼类
• 1.3.2 其它鱼类
• 1.4 多倍体鱼类生物学的研究进展
• 1.4.1 血液学与遗传学
• 1.4.2 生长
• 1.4.3 行为学
• 1.5 多倍体鱼类性腺和配子发育
• 1.5.1 硬骨鱼类性腺和配子发育
• 1.5.2 多倍体鱼类性腺和配子发育的研究进展
• 1.6 多倍体鱼类的生殖调控
• 1.6.1 鱼类生殖激素的种类
• 1.6.2 多倍体鱼类生殖调控的研究进展
• 1.7 论文研究内容
• 2 不同倍性虹鳟性腺发育的解剖学比较
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 不同倍性虹鳟制种
• 2.2.2 多倍体虹鳟倍性鉴定
• 2.2.3 解剖学测定
• 2.2.4 试验仪器与药品
• 2.3 结果
• 2.3.1 二倍体虹鳟性腺形态特征
• 2.3.2 三倍体虹鳟性腺形态特征
• 2.3.3 四倍体虹鳟性腺形态特征
• 2.3.4 不同倍性雌性虹鳟性体指数GSI 和肝体指数HSI
• 2.4 讨论
• 2.4.1 不同倍性虹鳟性腺发育的形态比较
• 2.4.2 不同倍性虹鳟性腺不同发育时期GSI 的变化
• 2.4.3 二倍体与三倍体雌性虹鳟GSI 和HSI 变化的相关性
• 2.5 结论
• 3 不同倍性虹鳟性腺发育和配子发生的组织学和超微结构观察
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 样本制备
• 3.2.2 性腺和配子发育时期划分
• 3.2.3 试验仪器与药品
• 3.3 结果
• 3.3.1 性腺组织学观察
• 3.3.2 性腺超微结构观察
• 3.4 讨论
• 3.4.1 二倍体虹鳟的卵黄发生
• 3.4.2 三倍体虹鳟的雌性不育
• 3.4.3 三倍体虹鳟精巢发育和精子发生特点
• 3.4.4 四倍体虹鳟的可育性
• 3.5 结论
• 2和T 含量的变化'>4 不同倍性虹鳟血清中GTH-I、GTH-II、17Β-E₂和T 含量的变化
• 4.1 引言
• 4.2 试验材料与方法
• 4.2.1 样本制备
• 4.2.2 试剂与仪器
• 2 和T 含量的测定'>4.2.3 血清中GtH-I、GtH-II、17β-E₂ 和T 含量的测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 GtH-Ⅰ含量的变化
• 4.3.2 GtH-Ⅱ含量的变化
• 2 含量的变化'>4.3.3 17β-E₂含量的变化
• 4.3.4 T 含量的变化
• 4.3.5 回收率
• 4.4 讨论
• 2 和T 的变化'>4.4.1 二倍体虹鳟GtH-Ⅰ、GtH-Ⅱ、17β-E₂ 和T 的变化
• 2 和T 的变化'>4.4.2 三倍体虹鳟GtH-Ⅰ、GtH-Ⅱ、17β-E₂ 和T 的变化
• 2 和T 的变化'>4.4.3 四倍体虹鳟GtH-Ⅰ、GtH-Ⅱ、17β-E₂ 和T 的变化
• 4.5 结论
• 5 二倍体与三倍体虹鳟卵黄蛋白原的组织定位
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 试验方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 卵黄蛋白的洗脱
• 5.3.2 卵黄蛋白电泳分析和分子量测定
• 5.3.3 糖、磷、脂蛋白分析
• 5.3.4 抗血清效价
• 5.3.5 卵黄蛋白原的免疫组化定位
• 5.4 讨论
• 5.4.1 虹鳟卵黄蛋白原的纯化
• 5.4.2 二倍体雌性虹鳟卵黄的发生
• 5.4.3 三倍体雌性虹鳟的卵黄蛋白原
• 5.4.4 雄性虹鳟的卵黄蛋白原
• 5.5 结论
• 6 不同倍性虹鳟的血液学研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试验材料
• 6.2.2 试验方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 不同倍性红细胞及其核的形态和大小
• 6.3.2 三倍体与二倍体虹鳟部分血液指标
• 6.3.3 三倍体虹鳟血细胞的发生
• 6.4 讨论
• 6.4.1 多倍体虹鳟红细胞的特征
• 6.4.2 三倍体虹鳟血细胞的发生场所
• 6.4.3 三倍体虹鳟血细胞发育的一般规律
• 6.4.4 多倍体虹鳟外周血液红细胞的异常分裂
• 6.5 结论
• 不同倍性虹鳟ONCORHYNCHUS MYKISS 性腺和配子发育及血细胞比较研究结论
• 致谢
• 参考文献
• 缩略语中英文对照
• 图版Ⅰ及说明
• 图版Ⅱ及说明
• 图版Ⅲ及说明
• 图版Ⅳ及说明
• 攻读博士学位期间发表的学术论文