hLF和Lys基因双T-DNA植物表达载体的构建及转化水稻的研究

论文摘要

在稻米储藏蛋白质中,赖氨酸（Lys）是第一限制性氨基酸,含量很低,使得稻米蛋白质的其它氨基酸不能被人体充分利用。提高稻米蛋白质的赖氨酸含量,可提高稻米蛋白质的利用率。人乳铁蛋白（hLF）可促进人体肠道对铁的吸收、调节体内铁的平衡,具有广谱抗菌、消炎、抑制肿瘤细胞生长、调节机体免疫反应等多种生理功能,这些功能若能为水稻所利用,将大大增加稻米的生物有效性。利用基因工程手段将高赖氨酸蛋白基因和人乳铁蛋白基因导入水稻中,可有效改善稻米的营养保健品质。为了消除转基因植物中选择标记基因带来的安全隐忠,本研究分别将目的基因（Lys基因、hLF基因）和标记基因（Hyg）构建在不同的T-DNA区,通过农杆菌介导遗传转化水稻,带选择标记基因的T-DNA和带目的基因的T-DNA可能整合到水稻基因组的不同染色体上,转基因植株后代发生自交分离后,可获得无选择标记的转基因水稻。本研究主要结果如下:1.构建了含有hLF基因的双T-NDA植物表达载体pCDHyg-hLF,该载体一个T-DNA区含潮霉素抗性基因hyg;另一个T-DNA区含hLF基因,hLF基因的启动子选用玉米Ubiquitin启动子。2.构建了含有Lys基因的双T-NDA植物表达载体pCDHyg-Lys,该载体一个T-DNA区含潮霉素抗性基因hyg;另一个T-DNA区含Lys基因,Lys基因的启动子选用水稻胚乳特异表达启动子GluB-1。3.构建了同时含有hLF基因与Lys基因的双T-NDA植物载体pCDHyg-Lys-hLF,该载体一个T-DNA区含潮霉素抗性基因hyg;另一个T-DNA区含Lys基因和hLF基因,这两个基因的启动子选用水稻胚乳特异表达启动子GluB-1。4.分别将以上三个双T-DNA植物表达载体转化优质粳稻台粳九号,其中pCDHyg-hLF转化台粳九号,经潮霉素筛选获得抗性愈伤30个,抗性愈伤分化成苗,共获得植株20株;pCDHyg-Lys转化台粳九号,获得抗性愈伤18个;pCDHyg-Lys-hLF转化台粳九号,获得抗性愈伤26个。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 本文主要缩写词表
• 1 文献综述
• 1.1 水稻转基因技术研究进展
• 1.1.1 水稻转化受体系统
• 1.1.2 转基因水稻的转化方法
• 1.1.3 转基因植物的检测方法
• 1.1.4 转基因水稻面临的问题
• 1.2 无选择标记转基因植物研究进展
• 1.2.1 标记基因
• 1.2.2 去除转基因植物中选择标记基因的必要性
• 1.2.3 去除选择标记基因的策略
• 1.3 外源基因在水稻品质遗传改良上的应用
• 1.3.1 淀粉品质改良
• 1.3.2 蛋白质改良
• 1.3.3 水稻微量元素改良
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 水稻受体材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒载体
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 PCR扩增引物
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水稻愈伤组织的诱导
• 2.2.2 菌种的活化及质粒的提取、酶切、回收、连接和转化
• 2.2.3 植物表达载体构建
• 2.2.4 植物表达载体转化农杆菌
• 2.2.5 农杆菌介导转化水稻
• 2.2.6 转基因植株的分子检测
• 3 结果与分析
• 3.1 台粳九号高频再生体系的建立
• 3.2 hLF、Lys双T-DNA表达载体的构建
• 3.2.1 hLF基因双T-DNA表达载体的构建
• 3.2.2 Lys基因双T-DNA无选择标记表达载体的构建
• 3.2.3 Lys和hLF双基因无选择标记共表达载体的构建
• 3.3 植物表达载体导入农杆菌
• 3.4 农杆菌介导转化台粳九号
• 3.4.1 农杆菌介导的hLF基因转化台粳九号
• 3.4.2 农杆菌介导的Lys基因转化台粳九号
• 3.4.3 农杆菌介导的hLF和Lys双价基因共转化台粳九号
• 4 讨论
• 4.1 转基因受体材料的选择
• 4.2 双T-DNA植物表达载体的构建
• 4.2.1 启动子的选择
• 4.2.2 双T-DNA共转化去除选择标记基因
• 4.3 农杆菌的种类、生长状态和浓度
• 5 主要结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后继研究展望
• 6 参考文献
• 附录1 本研究所采用的培养基配方
• 附录2 大肠杆菌质粒的小量提取
• 附录3 琼脂糖凝胶电泳回收目的片段
• 附录4 PCR产物或者酶切片段等DNA纯化回收
• 致谢