副粘病毒Tianjin株缺损干扰颗粒对大鼠脑胶质瘤细胞凋亡影响的初步研究

论文摘要

目的缺损性干扰（defective interfering,DI）颗粒是一种含有部分基因组的病毒颗粒,它是病毒在复制过程中发生错误而出现的,其基因组只是亚基因组片段,因不能执行完整的复制程序而不能独立复制,较完整的病毒颗粒更具有安全性。副粘病毒Tianjin株（Paramyxovirus,Tianjin Strain）是1999年从天津医科大学动物实验中心爆发急性上呼吸道感染的普通棉耳狨猴肺脏中分离出来的毒株,经鉴定属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属,与仙台病毒（Sendai virus,SeV）亲缘关系最近,不属于仙台病毒现有的3个进化分支而自成独立的一支。鉴于仙台病毒Tianjin株对成年人的低致病性,先前的实验表明仙台病毒其他基因型对肿瘤有抑制作用,以及本实验室前期工作已从多种肿瘤细胞中筛选出副粘病毒Tianjin株的敏感细胞为大鼠脑胶质瘤细胞C6。本课题拟通过仙台病毒Tianjin株缺损性干扰颗粒对肿瘤细胞的凋亡影响,探索不必外源基因的表达载体和不必具有直接溶瘤能力的病毒,利用仙台病毒Tianjin株缺损性干扰颗粒辅助治疗肿瘤的方法。并且初步探讨其影响肿瘤细胞凋亡的机理,以期为肿瘤治疗提供新的思路。方法将副粘病毒Tianjin株用鸡胚培养法连续传代三次,铺设5%～45%蔗糖密度梯度超速离心分离提纯副粘病毒Tianjin株DI颗粒。经紫外线照射获得灭活副粘病毒颗粒。通过电镜观察,体外接种到敏感细胞系大鼠脑胶质瘤细胞C6株观察细胞病变,接种鸡胚收集尿囊液检测血凝素效价等对DI颗粒和灭活病毒颗粒进行鉴定。体外培养大鼠脑胶质瘤细胞C6株,给予不同滴度的DI颗粒,另设副粘病毒Tianjin株组、灭活病毒颗粒组和空白对照组。分别于作用12 h、24 h、48 h、72 h后采用苏木素-伊红（HE）染色观察细胞形态变化;DNA片段的琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;流式细胞术定量检测细胞凋亡率和死亡率;TUNEL试剂盒检测凋亡细胞。并建立Westar大鼠C6脑胶质瘤动物模型,将培养的脑胶质瘤细胞C6接种到大鼠背部皮下,待荷瘤形成后,瘤内注射DI颗粒,并设立副粘病毒Tianjin株组、灭活病毒颗粒组和空白对照组。通过测量肿瘤大小观察皮下荷瘤的生长变化,取出皮下瘤组织,通过病理切片染色观察肿瘤组织病理变化、TUNEL试剂盒检测瘤组织细胞凋亡,研究DI颗粒对大鼠脑胶质瘤细胞凋亡的影响。结果实验结果确定纯化分离出的是与完整病毒有所差别的,无复制能力的缺损性颗粒成分,病毒颗粒经紫外线灭活后无感染和复制能力。细胞水平实验结果显示副粘病毒颗粒组和DI颗粒组HE染色能发现大鼠脑胶质瘤细胞的形态变化;DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图呈阶梯状;流式细胞仪和TUNEL定量检测发现随DI颗粒滴度的增加和作用时间的延长胶质瘤细胞C6凋亡率增高,与正常对照组比差异有统计学意义（P<0.05）;灭活病毒颗粒组和正常对照组比较差异无统计学意义。体内试验结果显示副粘病毒颗粒组和DI颗粒组动物和空白组比,皮下肿瘤生长受抑制,荷瘤组织标本病理切片HE染色结果显示瘤结节内瘤细胞较少;TUNEL原位细胞凋亡检测发现实验组细胞凋亡率比空白组高,差异有统计学意义。结论实验结果显示副粘病毒Tianjin株缺损性干扰颗粒在体内、外都能引起大鼠脑胶质瘤细胞凋亡,并且作用呈时间-剂量依赖型。提示副粘病毒Tianjin株DI颗粒具有辅助治疗肿瘤的可能性,为下一步的肿瘤治疗提供新思路。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、副粘病毒Tianjin株缺损性干扰颗粒的纯化及鉴定
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 副粘病毒Tianjin株的生物学活性检测
• 1.2.2 副粘病毒Tianjin株超速离心纯化结果
• 1.2.3 副粘病毒Tianjin株缺损性干扰颗粒和灭活病毒颗粒鉴定结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、副粘病毒Tianjin株缺损性干扰颗粒影响大鼠脑胶质瘤细胞凋亡的体外试验
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 HE染色细胞形态观察结果
• 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳结果
• 2.2.3 Annexin/PI标记流式细胞仪检测细胞凋亡结果
• 2.2.4 TUNEL检测细胞凋亡结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、副粘病毒Tianjin株缺损性干扰颗粒影响大鼠脑胶质瘤细胞凋亡的体内试验
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 50测定'>3.2.1 副粘病毒Tianjin株对实验动物的LD₅₀测定
• 3.2.2 大鼠胶质瘤动物模型
• 3.2.3 各组大鼠胶质瘤的病理观察结果
• 3.2.4 各组大鼠胶质瘤的TUNEL检测凋亡结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 病毒诱导肿瘤的现状和展望
• 综述参考文献
• 致谢