自体骨髓间充质干细胞经皮注射修复骨缺损的实验研究

论文摘要

目的：建立兔骨髓间充质千细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）的体外培养和成骨诱导体系。对BMSCs的抽取方式进行改良，评价BMSCs体外传代培养时不同培养基对BMSCs增殖能力的影响。比较自体BMSCs、成骨诱导后的BMSCs及二者联合经皮移植后体内成骨能力的差异，评价其经皮注射修复小段骨缺损的疗效，为骨组织工程选择种子细胞提供依据，为临床上治疗小段骨缺损以及骨不连提供一个新的思路。方法：1．抽取日本大耳白兔骨髓，用全骨髓培养法进行BMSCs的体外培养、扩增。取第2代BMSCs进行成骨诱导。定量测定培养液上清ALP活性，找出最强成骨活性的时间窗，并对成骨诱导前后的细胞增殖能力、成骨活性等生物学特性进行比较。2．随机将16只日本大耳白兔32侧髂部分为4组，前3组用骨穿针取骨髓，第4组用普通一次性20毫升加药注射器抽取骨髓，分别用α-MEM、DMEF-12、DMEM、DMEM行全骨髓培养法制备BMSCs。比较4组细胞长满培养瓶所需天数及第2代BMSCs生长曲线。3．制作新西兰大白兔桡骨中段15mm骨缺损模型，20只兔共40侧骨缺损模型随机分为5组，每组8侧。A组经皮植入自体1×106个BMSCs和1×106个己向成骨细胞诱导的BMSCs，B组植入2×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs，C组植入2×106个BMSCs，D组植入纤维蛋白胶复合5mgBMP，E组为空白对照组。术后对动物进行大体观察、摄X线片观察各组不同时相骨缺损修复情况，比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度、并于术后第4，8，12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察；取第12周标本进行生物力学检测。结果：1．骨髓穿刺针与普通一次性20毫升加药注射器所取骨髓经全骨髓培养法获得的BMSCs的数量及细胞形态、生长曲线没有统计学差异。2．α-MEM培养基比DMEM、DMEF-12行全骨髓培养法制备BMSCs所需时间大大缩短，加入骨诱导成分后成骨诱导效率更高。3．BMSCs与成骨诱导后的BMSCs联合移植组在12周内骨缺损区新生骨的数量和质量显著优于单纯移植BMSCs或单纯移植成骨诱导后的BMSCs，空白组骨缺损主要由纤维结缔组织填充。X线显示术后4周即可发现4组动物的桡骨缺损区域均有明显骨痂生成，第12周时A组即细胞联合移植组的骨缺损完全愈合，各时相局部X线阻射密度值显示，A、D组的新生骨痂最多，且可见髓腔再通现象；生物力学检测显示A组桡骨标本的四点弯曲断裂载荷均显著高于其余2实验组。结论：普通一次性20毫升加药注射器可代替骨穿针抽取兔髂嵴部位骨髓；α-MEM培养基比DMEM、DMEF-12更适合兔BMSCs的培养及成骨方向的诱导；.BMSCs与成骨诱导后的BMSCs联合移植具有更强的成骨能力，可作为种子细胞应用于骨组织工程。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 兔骨髓间充质干细胞的体外培养及其成骨诱导前后生物学特性的比较
• 实验目的
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 骨髓间充质干细胞抽取、培养方法的改良
• 实验目的
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 骨髓间充质干细胞经皮注射修复骨缺损的实验研究
• 实验目的
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 主要参考文献
• 文献综述
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢
• 附图