论文题目: 葡萄果实中脱落酸激活的钙依赖蛋白激酶：纯化、测序及定位
论文类型: 博士论文
论文专业: 果树学
作者: 李梅君
导师: 张大鹏
关键词: 葡萄果实,脱落酸,钙依赖蛋白激酶,绿色荧光蛋白,胶体金免疫电镜定位
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 脱落酸(ABA)是果实发育的一个重要调节因子,对其调控果实生长发育机制的研究,很重要的一方面是对其信号组分的鉴定。蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化过程在细胞信号转导中起关键的作用,因此,鉴定与ABA信号转导相关的蛋白激酶,对于揭示果实发育中ABA作用的细胞和分子机理具有重要意义。钙依赖的蛋白激酶(CDPK)是植物中特有的一种蛋白激酶,但是,据我们所知,目前ABA信号通路中CDPK的作用仍不清楚,所以,本研究具有更广泛的科学意义。 本实验应用胶内蛋白激酶自磷酸化分析表明,在葡萄果实微粒体中存在一种分子量约为62.5KD的钙依赖的蛋白激酶(CDPK),并且,外源ABA处理能激活这一蛋白激酶。由于CDPK和信号转导有关,是一种重要的信号分子,因此我们将实验的重点放在了这个蛋白激酶的纯化上。 制备葡萄果实微粒体,经过大量的SDS-PAGE电泳,将目的蛋白从胶上洗下来,低压冷冻干燥、富集,得到了电泳纯的目的蛋白。应用双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis)鉴定纯化产物的纯度,结果表明纯化产物中存在着分子量相近,但等电点不同的两种蛋白;接着分别用葡萄果实中CDPK(VCPKl)的全长和N-端特异抗体与双向电泳分离后的蛋白发生免疫反应,对纯化产物进行进一步的鉴定,准确地将目的蛋白从纯化产物中鉴定并分离出来。应用串连质谱仪(LC-MS/MS)测定目的蛋白CDPK的蛋白酶解的氨基酸序列,得到了MAPDKPLDSAVLSR;VIAEGLSEEEIGGLR;LTAHEVLSHPWVVDDR;NNLNLGDVLGIPDMR等序列。依据序列在数据库中检索发现,纯化的蛋白激酶的序列和本实验室利用CDPK的保守序列设计简并引物,筛选葡萄cDNA文库得到的一个CDPK基因编码的蛋白(VCPKI)序列完全相同,因此断定二者是同一种蛋白。筛选得到的CDPK已在gene bank登录,注册的基因和蛋白的序列号分别是gi 39598579/gb AAR 28766.1。 从三个方面对这个蛋白进行了定位(1)生化水平的定位:用两相分配法分离膜系统,分别与葡萄VCPK1全长和N-端特异抗体发生免疫反应;(2)亚细胞水平的定位:利用胶体金免疫电镜定位:(3)分子水平定位:构建载体包含CaMV-35S promoter,GFP和VCPK1信息,转化E.coli分别在拟南芥叶片、洋葱下表皮及拟南芥原生质体中瞬时表达,利用激光共聚焦扫描显微技术(confocal laser scanning microscopy)CLSM观察定位结果。上述实验的结果表明:VCPK1主要位于细胞的质膜和叶绿体上,而在其他亚细胞区域和细胞质外空间没有发现。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
缩略语表
第一章 文献综述
1 脱落酸在果实生长发育中的作用
1．1 果实成熟的两种类型
1．2 脱落酸对果实成熟的调控
2 脱落酸信号转导机理
2．1 ABA的感知
2．2 第二信使
2．3 ABA信号调节蛋白
2．4 下游信号组分
3 依赖钙不依赖钙调素的蛋白激酶(CDPK)
3．1 CDPK的结构
3．2 CDPK的理化特征
3．3 CDPK的活性调调节
3．4 CDPK在植物信号转导中的作用
3．5 CDPK的专一性
4 绿色荧光蛋白(GFP)
5 总结与展望
6 本研究的意义
第二章 脱落酸激活葡萄果实中一种钙依赖的蛋白激酶(CDPK)
1 材料与方法
1．1 植物材料
1．2 化学试剂
1．3 果实组织园片温育方法
1．4 果肉微粒体的制备
1．5 蛋白质含量的测定
1．6 SDS-PAGE和Western-blot
1．7 微粒体蛋白胶内自磷酸化
2 结果与分析
2．1 葡萄果实中存在钙依赖的蛋白激酶(CDPK)
2．2 脱落酸(ABA)激活葡萄果实中钙依赖的蛋白激酶(CDPK)
3 讨论
第三章 葡萄果实中钙依赖蛋白激酶的纯化与测序
1 材料与方法
1．1 植物材料
1．2 化学试剂及仪器
1．3 果肉微粒体的制备
1．4 蛋白质含量的测定
1．5 钙依赖蛋白激酶的纯化
1．6 纯化产物的胶内自磷酸化检测
1．7 纯化蛋白的双向凝胶电泳检测
1．8 纯化产物的Western-blot检测
1．9 串联质谱测定蛋白的序列
2 结果与分析
2．1 纯化产物的SDS-PAGE检测
2．2 葡萄果实中纯化的钙依赖蛋白激酶(CDPK)的特性
2．3 纯化产物的双向电泳和Western-blot的检测
2．4 串联质谱测定纯化CDPK的序列
3 讨论
第四章 葡萄果实钙依赖蛋白激酶的定位
1 GFP-VCPK1融合基因的构建及其在拟南芥、洋葱中的瞬时表达
1．1 实验材料
1．2 化学试剂
1．3 实验方法
1．4 实验结果
1．5 结论与讨论
2 葡萄果实中VCPK1的胶体金免疫电镜定位
2．1 实验材料和化学试剂
2．2 样品包埋
2．3 免疫染色
2．4 结果与讨论
3 葡萄果实中VCPK1的生化定位
3．1 实验材料
3．2 化学试剂
3．3 实验方法
3．4 结果与分析
讨论与结论
参考文献
致谢
个人简历
发布时间: 2005-07-22
参考文献
- [1].根域限制对葡萄果实品质影响的机理研究[D]. 冷锋.浙江大学2017
- [2].葡萄果实糖酸构成特点、遗传规律及庶糖与相关代谢酶关系的研究[D]. 刘怀锋.中国农业大学2005
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- [4].山葡萄果实转录组分析及白藜芦醇调控机理研究[D]. 殷向静.西北农林科技大学2016
- [5].微环境调控‘赤霞珠’葡萄果实花色苷代谢的研究[D]. 成果.西北农林科技大学2015
- [6].葡萄果实香气物质的QTL定位及关联分析研究[D]. 杨晓旭.沈阳农业大学2017
- [7].葡萄果实单萜化合物含量的QTL定位及其合成调控的候选基因筛选[D]. 刘翠霞.中国科学院武汉植物园2017
- [8].根域限制对葡萄果实发育、源库器官及其输导组织结构的影响[D]. 谢兆森.上海交通大学2010
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