心衰的机制与干细胞治疗基础研究

论文摘要

课题Ⅰ:SCN5A点突变导致扩心病发生的机制研究背景:心脏钠通道基因（cardiac sodium channel,SCN5A）突变可导致各类心律失常,现有观点认为SCN5A突变与扩心病有关,但其机理还不清楚并且争议很大。我们曾在一个进行性心脏传导障碍伴扩心病的遗传家系中,发现了一个新的SCN5A基因A1180V突变。本课题即试图在细胞及分子水平上观察该突变位点是否影响钙平衡从而造成心肌损伤。方法:以PacⅠ线性化重组腺病毒质粒pAdGFP-SCN5A（MT/WT）,经线性化后转染到HEK 293细胞中包装成病毒,随后提取DNA进行PCR鉴定和测序鉴定。重组腺病毒Ad-GFP-SCN5A（MT/WT）经HEK293传代、扩增、浓缩与纯化,并测定病毒滴度(TCID50和PFU)。将这些病毒按如下分组接种新生大鼠心肌细胞:对野生型SCN5A和突变型SCN5A分别设置缺氧组、缺氧并加xamoterol处理组、xamoterol组和空白组。接种病毒48小时后,以缺氧和xamoterol处理2小时后,随后进行如下实验:（1）提取RNA,经realtime PCR,观察钠和钙相关基因(L-Ca2+、CaMKⅡ、NaCX、PLB、CaM、SERCA、RyR2)的表达情况;（2）加载钙荧光指示剂X—rhod—1,以激光共聚焦显微镜测定心肌细胞内钙信号的变化情况;（3）用Annexin-V-PE联合碘化丙锭（PI）流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。对数据采用SPSS10.0统计软件进行ANOVA方差分析,p＜0.05为差异显著,p＜0.01为差异极显著。结果:经PacI酶切线性化的腺病毒质粒pAd-GFP-SCN5A（MT/WT）用脂质体介导转染HEK293细胞后,产生的重组腺病毒对HEK 293细胞有致病作用。用目的基因片段SCN5A引物进行PCR扩增,得到一条约5006p大小片段,测序后经序列分析表明SCN5A未发生新的突变,表明带有目的基因的重组腺病毒Ad-GFP-SCN5A（MT/WT）构建成功。重组腺病毒Ad-GFP-SCN5A（MT/WT）经HEK293传代、扩增、浓缩与纯化,获得滴度分别为PFU 7×108.4的Ad-GFP-SCN5A（MT）和PFU 7×107.8的Ad-GFP-SCN5A（WT）。分别接种HEK293和新生鼠心肌细胞,GFP阳性率在90%以上,说明病毒能够感染大部分细胞。从与钠和钙相关基因表达的情况来看,CaM和SERCA其表达量各组之间差异不显著;PLB在SCN5A野生型空白组表达显著高于其它各组（p＜0.05）,其它基因其表达规律性不强。SCN5A MT空白组和SCN5A WT Xamoterol处理组之间钙瞬变差异显著（p＜0.05）,各组间钙容量差异不显著,钙瞬变和钙容量均在数量上表现出SCN5A MT各组高于SCN5A WT各组的趋势。SCN5A MT缺氧并Xamoterol处理组和SCN5A MT空白组钙升高时间显著高于除这两组之外的其它各组（p＜0.05）,除空白组间WT和MT间钙衰减时间差异显著外,其它对应组间差异不显著（p＜0.05）,钙升高和钙衰减均在数量上表现出SCN5A MT各组低于SCN5A WT各组的趋势。各SCN5A MT组其细胞凋亡均显著高于相应的SCN5A WT组（p＜0.05）。结论:钙信号的变化和细胞凋亡的结果一致表现出SCN5A A1180突变可增强心肌细胞内钙信号。这说明SCN5A A1180V突变导致的非失活内向钠电流增加引起了细胞内钙信号加强。这将支持SCN5A A1180V突变可导致心肌细胞内钙稳态失衡从而引起扩心病的假设。课题Ⅱ:BMP2诱导人MSCs向心肌样细胞分化的可能性及其机制背景骨形态发生蛋白2（BMP2）可诱导间充质干细胞（MSCs）成骨和脂肪细胞,尚未有经BMP2诱导MSCs向心肌样细胞方向分化的报道。RUNX2和PPARγ分别是向骨和脂肪细胞分化下游通路上两个关键转录因子。BMP2诱导胚胎干细胞ESC和P19CL6可分化成心肌样细胞,MSCs经5-aza诱导也可分化成心肌样细胞,在BMP2通路上,成骨和成脂肪细胞分化是可以切换的,因此,有理由设想也可向心肌细胞方向切换。本课题试图通过下调转录因子RUNX2和PPARγ的表达来观察BMP2诱导下的MSCs可否向心肌样细胞方向分化。方法第一章:抽取人髂骨骨髓,经Ficoll密度梯度离心分离获得单个核细胞,分别经不同的培养基传代培养。以流式细胞仪鉴定其表面抗原,同时,对这些细胞经向脂肪细胞分化的化学诱导剂诱导。通过上述方法,获得生长性能良好的间充质干细胞株。第二章:以pEGFP-N1构建PPARγ和RUNX2基因的真核表达质粒,将这些基因通过脂质体转染或电转的方式转染到MSCs和HEK293细胞,选择转染率高的方法和高转染的细胞。将经化学合成的PPARγ和RUNX2siRNA与相应的质粒用lipo2000转染到HEK293细胞中,筛选下调基因表达最低的PPARγ和RUNX2 siRNA片段及相应片段的最佳浓度。第三章:以Lipofectamine RNAi MAX将BLOCK-iTTM Alexa Fluor? Red Fluorescent Oligo（Invitrogen USA）转染到MSCs,以评价RNA传送到MSCs的效率。按如下分组诱导MSCs的分化:（1）5-aza、BMP2、PPARγ和RUNX2的siRNA,（2）BMP2、PPARγ和RUNX2的siRNA,（3）5-aza、BMP2,（4）BMP2,（5）5-aza,（6）Control（Blank）。培养基中5-aza的终浓度为0.01uM,BMP2终浓度为100ng/ml,PPARγ和RUNX2的siRNA所加量分别为10pmol/孔（六孔板）。MSCs生长到70%的汇合度时,以5-aza处理细胞24小时,然后换液培养24小时即转染PPARγ和RUNX2的siRNA,6天后再转染一次,BMP2在70%的汇合度时即开始添加,每2天换液一次,12天后收细胞,提取RNA和蛋白,经RT—PCR、realtime PCR和western blotting,检测PPARγ、RUNX2、NKX2.5、GATA4、α-MHC和cTnT基因的表达情况。对数据采用SPSS10.0统计软件进行ANOVA方差分析,p＜0.05为差异显著,p＜0.01为差异极显著。结果第一章:对抽取的骨髓分离纯化,传代培养,15天即铺满培养瓶底,梭形细胞比例增加,细胞得到纯化,但传至P3,细胞由梭形变为平坦、宽大,细胞立体感逐渐消失,细胞的形状趋向多样,说明细胞很快衰老。换用添加有补充物的MSCs专用培养基培养,MSCs则生长状态良好。样本经流式细胞仪鉴定表面抗原,MSCs高表达CD29（97.69%）和CD166（97.54%）,但不表达CD34和CD45。同时,以化学诱导剂（MDI）成功的诱导这些细胞分化成为脂肪细胞。经诱导和鉴定表面抗原,说明所获得的细胞是高纯度的MSCs。第二章:经PCR鉴定和测序鉴定,成功的构建了以pEGFP-N1为载体的PPARγ和RUNX2基因真核表达质粒。将这些质粒与PPARγ和RUNX2 siRNA共转到HEK293,其中PPARγsiRNA的P2片段（5’AGAAUAAUAAGGUGGAGAUGCAGGC3’）在mRNA水平和蛋白水平上均显著下调PPARγ的表达（p＜0.05）,而RUNX2 siRNA的3片段（R1:5’UUUAAUAGCGUGCUGCCAUUCG AGG3’,R2:5’AACAGAUUCAUCCAUUCUGCCACUA3’,R3:5’UCAAGCUUCUGUCUGUGCCUUCUGG3’）均显著下调RUNX2的表达（p＜0.05）,同时,筛选得P2片段的最佳下调浓度为10pmol/孔（六孔板）（p＜0.05）,R2片段两个最佳下调浓度为10pmol╱孔和25pmol/孔（p＜0.05）。第三章:将Fluor Red RNA转染到MSCs,发现60%以上的RNA传送到了MSCs,说明有较高的传送效率经BMP2诱导,发现第4组（BMP2）PPARγ的表达显著高于其它各组,RUNX2的表达也在第4组最高,但无统计学上的差异。转录因子Nkx2.5和GATA4和心肌特异性基因TnT和MHC的表达在第1组（5-aza、siRNA和BMP2）一致性的显著升高（p＜0.05）,并且显著高于第5组（5-aza）,而第5组这些基因的表达也显著高于除第1组之外的其它各组（p＜0.05）。说明在诱导过程中,PPARγ和RUNX2被相应siRNA抑制,单因素5-aza和BMP2均不占主导作用,BMP2与5-aza产生了协同效应,促进了MSCs向心肌样细胞分化。结论抑制转录因子RUNX2和PPARγ的表达使得BMP2诱导MSCs向心肌样细胞分化是可行的,其机制可能在于BMP2下游信号通路间的串联和切换。课题Ⅲ:CTSS基因启动子区-25G/A多态对中国人群冠心病的预测背景:动脉粥样硬化是一种以动脉管壁细胞外基质结构广泛重构为特征的炎症性疾病。最近许多研究显示诸如组织蛋白酶S（CTSS）等的溶酶体半胱氨酸蛋白酶参与动脉粥样硬化形成过程。在CTSS基因的启动子区域核苷酸-25处存在G/A基因多态现象。基于CTSS在冠状动脉粥样硬化中发挥重要作用,而-25G/A多态位于CTSS基因启动子区域,因此,我们推测CTSS -25G/A多态性可能与冠心病之间存在密切联系。本项研究的目的即为观察中国人群中,CTSS-25G/A多态分布及其多态性与冠心病（CAD）危险性之间的关联。方法:CTSS基因-25G/A多态性由多聚酶链式反应PCR及限制性内切酶降解方法获得。经冠脉造影检查明确的共659名冠心病患者（冠脉狭窄≥50%）及352名非冠心病患者（对照组）纳入本项研究。我们同时收集患者的吸烟史、高血压史及糖尿病史,并测量他们的血脂水平。结果:所有研究对象中的等位基因G和A的频率分别为0.630及0.370。在病例组及对照组之间未发现其CTSS -25G/A多态性频率（G:0.626 vs.0.633,p＞0.05;A:0.374 vs.0.367,p＞0.05）及基因型分布（G:83.4 vs.85.3,p＞0.05;A:58.0vs.58.5,p＞0.05）存在显著性差异。此外,即使在使用逻辑回归对其他危险因素校正后,CTSS基因型与冠脉狭窄严重程度之间亦未发现存在关联（p＞0.05）。结论:在中国人群中,基因型AA较基因型GG和GA更为少见。对照组及冠心病组之间的等位基因频率及基因型分布均无显著性差异。CTSS -25G/A多态性与冠状动脉狭窄的发生率及严重程度不相关。

论文目录

• 课题Ⅰ摘要
• 摘要
• Abstract
• 课题Ⅱ摘要
• 摘要
• Abstract
• 课题Ⅲ摘要
• 摘要
• Abstract
• 课题Ⅰ:SCN5A点突变导致扩心病发生的机制研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 HEK293细胞培养
• 1.2.1.1 HEK293细胞的复苏
• 1.2.1.2 HEK 293细胞的传代培养
• 1.2.1.3 HEK 293细胞的冻存
• 1.2.2 重组腺病毒pAd-SCN5A的构建与扩增
• 1.2.2.1 重组腺病毒pAd-SCN5A的构建
• 1.2.2.2 阳性细胞克隆的筛选及重组腺病毒小量扩增
• 1.2.2.3 重组腺病毒载体的PCR鉴定
• 1.2.2.4 重组腺病毒的大量扩增和保存
• 1.2.2.5 重组腺病毒的浓缩与纯化
• 1.2.2.6 病毒滴度测定
• 1.2.3 心肌细胞的分离与培养
• 1.2.4 心肌特异性β-受体激动剂浓度的选择
• 1.2.5 钙荧光指示剂的选择
• 1.2.6 激光共聚焦测定心肌细胞钙变化
• 1.2.6.1 分组及接种病毒
• 1.2.6.2 β-受体激动剂和缺氧处理心肌细胞
• 1.2.6.3 钙荧光指示剂负载
• 1.2.6.4 共聚焦显微镜钙成像
• 1.2.6.5 肌质网钙容量的测定
• 1.2.7 Realtime PCR检测钠钙相关基因表达情况
• 1.2.8 荧光双标记流式细胞仪测定细胞凋亡
• 1.2.9 数据的统计与分析
• 2 结果
• 2.1 重组腺病毒Ad-GFP-SCN5A（MT/WT）的构建与鉴定
• 2.2 重组腺病毒Ad-GFP-SCN5A（MT/WT）的扩增、纯化及滴度测定
• 2.3 β-受体激动剂Xamoterol浓度的选择
• 2.4 钙指示剂的选择
• 2.5 重组病毒感染后钙相关基因的表达情况
• 2.6 共聚焦显微镜钙成像相关指标的结果
• 2.7 细胞凋亡结果
• 3 讨论
• 3.1 腺病毒的构建、鉴定、浓缩与纯化
• 3.2 对实验分组方案及选择的检测指标的解释
• 2+的关系'>3.3 SCN5A A1180V突变与Ca²⁺的关系
• 4 结论
• 参考文献
• 课题Ⅱ:BMP2诱导人MSC向心肌样细胞分化的可能性及其机制
• 第一章 人骨髓间充质干细胞的获取与鉴定
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞来源
• 1.1.2 细胞培养相关试剂及用品
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.1.4 主要试剂配制
• 1.2 方法
• 1.2.2 人骨髓间充质干细胞的分离
• 1.2.3 人骨髓间充质干细胞来源与培养基的选择
• 1.2.4 人骨髓间充质干细胞的鉴定
• 1.2.4.1 流式细胞仪鉴定表面抗原
• 1.2.4.2 化学诱导向脂肪细胞分化
• 1.2.4.2.1 诱导方案
• 1.2.4.2.2 油红染色
• 2 结果
• 2.1 MSCs原代培养情况
• 2.2 MSCs传代培养情况
• 2.3 MSCs培养基的选择
• 2.4 MSCs的表型特征
• 2.5 MSCs诱导为脂肪细胞的形态变化
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第二章 PPARγ和RUNX2 siRNA片段的筛选
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 溶液及其配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 PPARγ和RUNX2真核表达质粒的构建
• 1.2.1.1 引物与siRNA
• 1.2.1.2 基因的扩增与电泳
• 1.2.1.3 PCR产物的回收与纯化
• 1.2.1.4 pEGFP-N1质粒的制备
• 1.2.1.4.1 感受态细胞的制备
• 1.2.1.4.2 质粒的转化
• 1.2.1.4.3 质粒的抽提
• 1.2.1.5 双酶切
• 1.2.1.6 连接
• 1.2.1.7 重组质粒的转化
• 1.2.1.8 重组质粒的抽提
• 1.2.1.9 重组质粒的鉴定
• 1.2.1.9.1 PCR鉴定
• 1.2.1.9.2 序列测定与序列分析
• 1.2.2 PPARγ和RUNX2 siRNA片段及浓度的筛选
• 1.2.2.1 转染细胞与转染方式的选择
• 1.2.2.2 RNA传送效率的判断
• 1.2.2.3 siRNA和重组质粒共转到HEK293
• 1.2.2.4 蛋白的提取
• 1.2.2.5 蛋白浓度的测定
• 1.2.2.6 RNA的提取
• 1.2.2.7 cDNA的合成
• 1.2.2.8 聚合酶链式反应（PCR）
• 1.2.2.9 Western blotting
• 1.2.2.10 RT-PCR筛选siRNA片段及浓度
• 1.2.2.11 Realtime-PCR筛选siRNA片段及浓度
• 1.2.3 数据的统计与分析
• 2 结果
• 2.1 将PPARγ和RUNX2基因的扩增
• 2.2 酶切
• 2.3 质粒的鉴定
• 2.4 质粒转染方式与转染细胞的选择
• 2.5 RNA的传送效率
• 2.6 质粒与siRNA片段共转293细胞
• 2.7 PPARγ siRNA有效片段的筛选
• 2.8 RUNX2 siRNA有效片段的筛选
• 2.9 siRNA共转对基因的抑制及siRNA浓度的选择
• 3 讨论
• 3.1 PPARγ和RUNX2重组质粒的构建
• 3.2 转染方式与转染细胞的选择
• 3.3 PPARγ和RUNX2基因siRNA有效片段和有效浓度的筛选
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 BMP2诱导MSC向心肌样细胞分化的探讨
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 siRNA传送到MSC效率的评估
• 1.2.2 诱导与抑制的方案
• 1.2.3 fluo-red RNA和siRNA转染MSC细胞
• 1.2.4 RNA的提取
• 1.2.5 cDNA的合成
• 1.2.6 PCR检测基因的表达
• 1.2.7 Realtime-PCR检测基因的表达
• 1.2.8 数据的统计与分析
• 2 结果
• 2.1 RNA传送到MSC效率的评估
• 2.2 诱导的各组细胞光镜下观察结果
• 2.3 MSC经诱导和干扰后基因的表达
• 3 讨论
• 3.1 对诱导与抑制方案的解释
• 3.2 指标性转录因子与结构蛋白的选择
• 3.3 MSC诱导与抑制过程中基因表达情况分析
• 3.4 机制的探讨
• 4 结论
• 参考文献
• 课题Ⅲ:CTSS基因启动子区-25G/A多态对中国人群冠心病的预测
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 病例组与对照组
• 1.2.2 基本特征及定义
• 1.2.3 基因分型
• 1.2.3.1 DNA提取
• 1.2.3.2 组织蛋白酶S基因扩增
• 1.2.3.3 组织蛋白酶S基因多态性分析
• 1.2.4 统计分析
• 2 结果
• 2.1 基本特征
• 2.2 基因型分布
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附1 用于构建重组粒的PPAR γ序列分析
• 附2 用于构建重组粒的RUNX2序列分析
• 附3 pEGFP-N1质粒的酶切位点
• 附4 文献综述
• 附5 论文发表与参加的学术会议