马铃薯花色苷及其生物合成的主要关键酶基因的克隆与表达分析

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum）是仅次于小麦、玉米和水稻的第四大粮食作物。其块茎是繁殖器官，也是产品器官。块茎有不同颜色，如白色、红色和紫色。花色苷是有色块茎颜色的决定因子，作为天然色素，花色苷可应用于食品、医药和化妆品等行业。同时，它被证明具有抗癌、抗氧化和预防心血管疾病的作用。因此，近年来有关花色苷的生化与分子生物学研究，引起了全世界科学家的广泛关注和浓厚兴趣。花色苷的生物合成途径是被最为广泛而深入研究的植物次生代谢途径，特别在主要模式植物中，已经有了清楚的认识。一些花色苷生物合成途径中的关键酶基因，已经从马铃薯栽培种（S．tuberosum L．）中克隆到，如CHS基因、F3H基因、DFR基因和F3’5’H基因，而在马铃薯野生种（S．pinnatisectum）中，还未见到花色苷生物合成酶基因克隆及其表达研究的报道。本研究以野生种为材料，克隆了CHS、F3H、DFR和3GT四个基因，分析了这四个基因的表达情况，通过转基因对3GT基因进行了功能验证；以马铃薯栽培种（S．tuberosum cv．Chieftain）为材料，研究了CHS、F3H、F3’5’H、DFR和3GT五个基因的组织表达和诱导表达。研究的主要结果如下：1．马铃薯花色苷的种类、含量和稳定性及影响其生物合成的因素用1％（v／v）盐酸甲醇溶液分别从红色和紫色马铃薯中提取色素，用正已烷除杂，再经薄层层析（TLC）纯化后，在紫外-可见分光光度计下扫描。根据提取液特性、Rf值和紫外-可见光谱特点，参考已有相关资料，初步判断马铃薯紫色色素主要为锦葵素的衍生物，而红色色素主要为天竺葵素衍生物。紫色马铃薯的花色苷含量是红色马铃薯花色苷含量的2.9倍。光、热和pH值对花色苷的稳定性有显著影响，但紫色马铃薯花色苷的稳定性好于红色马铃薯花色苷。愈伤组织来源于马铃薯品种Chieftain，在红色愈伤组织中，低浓度的2，4-D有利于花色苷的积累，高浓度的2，4-D促进愈伤组织的生长而不利于花色苷的积累；高浓度的6-BA能促进红色愈伤组织中花色苷的积累和诱导白色愈伤组织合成花色苷，但抑制生长；卡那霉素能使白色愈伤组织变红并积累花色苷，随着卡那霉素浓度的提高，愈伤组织生长受到严重抑制并最终变褐死亡；提高蔗糖浓度能促进马铃薯愈伤组织花色苷的产生和积累而抑制生长。2．马铃薯野生种花色苷生物合成相关基因的克隆与序列分析设计简并引物，通过RT-PCR方法从马铃薯野生种（S．pinnatisectum）紫色芽的cDNA中克隆到了CHS、F3H、DFR和3GT基因的全长cDNA。序列分析表明，以上四个基因分别编码389、358、382和448个氨基酸残基的多肽，在氨基酸水平上与茄科植物相应多肽的同源性最高，达到76-96％；多重比较和系统发育分析表明它们分别属于各自基因家族中的一员。3．马铃薯野生种3GT基因的功能验证为了验证马铃薯野生种3GT基因的功能，构建带CaMV 35S启动子的表达载体pG3GT，转化农杆菌GV3101，用茵液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化，在含50mg／LKan的1／2MS培养基上筛选，得到4个抗性幼苗，转化率为0.13％，对移栽成活的3株进行PCR检测为阳性，Southern blot分析2株表现为阳性并为单拷贝整合。其中一株的叶片和茎杆颜色变成紫红色，经花色苷含量的测定表明其含量比野生型植株高出7.01倍，从而初步验证了3GT基因的功能和活性。4．马铃薯花色苷生物合成相关基因的表达分析用RT-PCR分析了马铃薯野生种的CHS、F3H、DFR和3GT基因的空间表达情况，这些基因主要在花、匍匐茎和顶芽中表达，除3GT基因外，其它3个基因在根中的表达没有检测到，CHS在根和块茎中没有检测到。在马铃薯野生种的白色块茎中这些基因在光诱导之前表达量很低或不表达，但在光照之后表达量显著增加，随着光照时间的延长，白色块茎变为紫红色，花色苷大量积累。用RT-PCR分析了CHS，F3H，DFR、F3’5’H和3GT五个基因在马铃薯栽培种Chieftain植株中的表达情况，结果表明，这些基因在匍匐茎的表达量最高，这与其花色苷积累量也较高是相一致的。在块茎中五个基因均有表达，但表达量相对较低，这可能与花色苷仅在红色表皮组织中合成而在占大部分体积的白色薯肉中不合成有关。在附加6-BA为2mg／L、2，4-D为0.5 mg／L的MS培养基上，分离到绿色、白色和红色三种愈伤组织（细胞系），三种愈伤组织在叶绿素和花色苷的含量上显著不同，其中绿色和白色愈伤组织中几乎不含花色苷，而红色愈伤组织则大量积累花色苷。对CHS、F3H、DFR、F3’5’H和3GT五个花色苷生物合成相关基因分析表明，绿色和白色愈伤组织不合成花色苷主要是由于DFR基因不表达造成的。稀土元素铈对马铃薯悬浮培养的愈伤组织中花色苷积累及其生物合成基因的表达有显著影响。研究表明，低浓度Ce4+能促进细胞和愈伤组织的生长，而高浓度Ce4+则抑制生长并导致细胞死亡。不同浓度的Ce4+能诱导正常的愈伤组织变红并积累花色苷。RT-PCR分析表明，用0.1 mM Ce4处理悬浮培养的愈伤组织能显著诱导以上五个基因的表达，其表达量与花色的含量呈协同关系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写及中文对照表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物花色苷的分布、种类、结构、理化性质、生理功能和应用
• 第二章 花色苷的生物合成与基因工程
• 第三章 马铃薯花色苷研究进展
• 第二部分 试验研究
• 第一章 马铃薯花色苷种类、稳定性及影响其生物合成的因素
• 第一节 前言
• 第二节 马铃薯花色苷种类、含量和稳定性的初步研究
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 马铃薯色素种类的分析
• 1.2.2 色素含量的测定
• 1.2.3 不同光、温和pH条件下色素稳定性检测
• 2 结果分析
• 2.1 马铃薯块茎的颜色和相应色素提取液的颜色
• 2.2 马铃薯色素的薄层层析（TLC）
• 2.3 马铃薯色素的紫外/可见分光光谱
• 2.4 马铃薯色素的含量
• 2.5 光照对马铃薯花色苷颜色的影响
• 2.6 温度对马铃薯花色苷颜色的影响
• 2.7 pH对马铃薯花色苷颜色的影响
• 3 讨论
• 第三节 马铃薯栽培种愈伤组织花色苷的积累受激素、抗菌素和糖的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 激素对愈伤组织生长和花色苷积累的影响
• 1.2.2 抗菌素对愈伤组织生长和花色苷积累的影响
• 1.2.3 蔗糖对愈伤组织生长和花色苷积累的影响
• 1.2.4 愈伤组织生长量的测定
• 1.2.5 愈伤组织中花色苷含量的测定
• 2 试验结果
• 2.1 2，4-D对愈伤组织生长和花色苷积累的影响
• 2.2 6-BA对愈伤组织生长和花色苷积累的影响
• 2.3 6-BA能诱导白色愈伤组织变红并积累花色苷
• 2.4 卡那霉素诱导白色愈伤组织变红并积累花色苷
• 2.5 蔗糖对愈伤组织生长和花色苷积累的影响
• 3 讨论
• 第二章 马铃薯野生种花色苷生物合成基因的克隆与序列分析
• 第一节 前言
• 第二节 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与试剂盒
• 1.3 缓冲液、生化试剂和培养基
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 总 RNA的提取
• 2.2 总 RNA的定量与完整性检测
• 2.3 cDNA第一链的合成
• 2.4 引物的设计
• 2.5 CHS、F3H、DFR和3GT基因的PCR扩增条件和程序
• 2.6 目的片段的回收
• 2.7 目的片段与克隆载体 PMD18-T连接
• 2法制备感受态细胞'>2.8 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.9 目的片段的转化及阳性克隆的鉴定
• 2.10 序列测定与分析
• 2.11 基因组 DNA的大量提取
• 2.12 基因组 DNA的酶切与转膜固定
• 2.13 Souther杂交
• 第三节 结果与讨论
• 1 结果分析
• 1.1 CHS、F3H、DFR和3GT基因的克隆
• 1.2 CHS、F3H、DFR和3GT基因的序列分析
• 1.2.1 CHS的序列与功能分析
• 1.2.2 F3H的序列与功能分析
• 1.2.3 DFR的序列与功能分析
• 1.2.4 3GT的序列与功能分析
• 1.3 CHS、F3H、DFR和3GT基因的 Southern杂交分析
• 2 讨论
• 第三章 马铃薯3GT基因的功能验证
• 第一节 前言
• 第二节 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 主要生化试剂
• 1.3 质粒和菌种
• 2 试验方法
• 2.1 质粒提取
• 2.2 表达载体的构建
• 2.3 大肠杆菌的转化
• 2.4 农杆菌的转化
• 2.5 拟南芥的遗传转化与转化体的筛选
• 2.6 拟南芥基因组 DNA的简易提取与 PCR检测
• 2.7 拟南芥 PCR阳性植株 Southern blot分析
• 2.8 拟南芥转化体的 RT-PCR表达分析
• 2.9 拟南芥中花色苷含量的测定
• 第三节 结果与讨论
• 1 结果分析
• 1.1 转化农杆菌
• 0代种子的卡那霉素筛选'>1.2 农杆菌介导转化拟南芥后 T₀代种子的卡那霉素筛选
• 1.3 转基因植株 PCR检测
• 1.4 转基因植株的 Southern blot分析
• 1.5 转基因植株的表达分析
• 1.6 转基因植株的表型和花色苷含量
• 2 讨论
• 第四章 马铃薯花色苷生物合成相关基因的表达分析
• 第一节 前言
• 第二节 马铃薯野生种花色苷生物合成相关基因的表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 总 RNA提取和cDNA第一链的合成
• 1.2.2 CHS、F3H、DFR和3GT基因在块茎中的光诱导表达分析
• 1.2.3 花色苷提取与含量的测定
• 2 结果分析
• 2.1 CHS、F3H、DFR和3GT基因的空间表达分析
• 2.2 光诱导块茎花色苷生物合成基因的表达而导致花色苷的积累
• 3 讨论
• 第三节 马铃薯栽培种花色苷生物合成相关基因的表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 无菌苗的培养
• 1.2.2 愈伤组织的培养
• 1.2.3 总 RNA提取和cDNA第一链的合成
• 1.2.4 引物设计与序列分析
• 1.2.5 愈伤组织生长量和花色苷浓度的测定
• 1.2.6 叶绿素含量的测定
• 2 结果与讨论
• 2.1 花色苷生物合成相关基因在不同组织器官的的表达
• 2.2 绿色、白色和红色愈伤组织的生长、叶绿素含量和花色苷积累及其生物合成相关基因表达差异分析
• 2.2.1 绿色、白色和红色愈伤组织的生长量
• 2.2.2 绿色、白色和红色愈伤组织的叶绿素含量
• 2.2.3 绿色、白色和红色愈伤组织的花色苷积累及生物合成基因表达差异分析
• 2.3 稀土元素铈对悬浮培养愈伤组织花色苷积累及其生物合成基因表达的影响
• 4+对愈伤组织生长的影响'>2.3.1 Ce⁴⁺对愈伤组织生长的影响
• 4+对愈伤组织花色苷产生和积累的影响'>2.3.2 Ce⁴⁺对愈伤组织花色苷产生和积累的影响
• 4+对愈伤组织中花色苷生物合成基因表达的影响'>3.3.3 Ce⁴⁺对愈伤组织中花色苷生物合成基因表达的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论与展望
• 一、本研究的主要结论
• 二、问题与展望
• 主要创新点
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的研究论文
• 致谢