论文摘要
14-3-3蛋白家族广泛存在于各种真核生物中，包括真菌，植物和动物。14-3-3蛋白是一种可溶性酸性蛋白，占动物脑组织可溶性蛋白总含量的1%。14-3-3蛋白能与具有磷酸化丝氨酸、苏氨酸的序列的200余种蛋白结合，在细胞分裂增殖、生长分化、调亡代谢、信号转导中发挥着重要作用。已知真核细胞中14-3-3总共有7种亚型：β、ε、γ、η、σ、τ、ζ。研究表明，不同亚类14-3-3与神经退行性疾病关系密切，如Alzheimer’s病、Parkinson’s病、Creutzfeldt-Jakob病脑脊液中均检测到14-3-3β、γ蛋白的增高。我们前期的研究表明在缺氧缺糖培养的星形胶质细胞中，14-3-3γ蛋白的表达增加可减少其调亡。本项目利用细胞和动物缺血模型进一步研究了14-3-3蛋白在缺血损伤神经元中的表达、功能和保护机制。在原代培养的小鼠大脑皮层神经元中，缺氧缺糖培养可以诱导14-3-3γ基因和蛋白表达显著升高。在大鼠急性脑缺血再灌注的模型中，采用免疫组织化学、免疫印迹、RT-PCR等方法，检测了14-3-3各亚类及相关凋亡蛋白表达。免疫组化结果显示：在脑缺血损伤的半阴影区，与对侧相比14-3-3γ、β阳性细胞数量和蛋白表达强度有明显的增高，而14-3-3??、?、?亚型变化不明显；在相同区域内凋亡相关蛋白Bax、?-catenin和p53阳性细胞表达也显著增高。Western blot和RT-PCR方法也证明缺血可特异诱导14-3-3??表达的增加。进一步在N2a细胞中研究14-3-3蛋白在缺糖缺氧损伤过程中的细胞保护作用：LDH释放实验证明，过表达14-3-3蛋白抑制肽或14-3-3?siRNA质粒可明显加重细胞的损伤，而过表达14-3-3?可以显著减轻细胞的损伤。14-3-3蛋白可通过多种机制发挥抗凋亡作用。我们发现过表达14-3-3蛋白，主要是?亚型可以显著降低凋亡相关蛋白Bax和p53的表达。同时，通过免疫共沉淀方法还证明14-3-3?与磷酸化?-catenin的结合在缺糖缺氧处理神经元中显著增加，而在相同条件下未检测到14-3-3?与Bax、p-Ask1的结合。这些结果证明14-3-3蛋白的选择性表达增多是脑缺血神经元的一个重要的内源性保护机制；14-3-3?可以通过降低Bax和p53的表达或通过调节?-catenin信号通路起到抗凋亡作用。14-3-3蛋白及其相关的抗凋亡通路可能成为防治脑卒中的新靶点。