β-氨基丁酸诱导辣椒抗病作用及其机理研究

论文摘要

诱导抗性或获得抗性是植物受病原物侵染或化学物质处理后能产生对随后病原物的侵染的抗性。不同的生物或非生物诱抗剂能诱导植物对病害获得局部或系统抗性,这些诱抗剂能通过不同的信号途径激活信号网络中的某一点从而诱导不同的植物产生特异性蛋白抵抗病虫害的攻击。系统获得抗性（SAR）是一种特殊形式的诱导抗性,具有系统、持久、抗病谱广等三大特点。研究开发诱导植物抗病性的物质具有重要的理论和实践意义。β-氨基丁酸（BABA）是一种具有广谱诱抗活性的植物化学诱抗剂,为了研制和开发该类氨基酸农药制剂,对BABA及其合成制剂温室诱导辣椒和番茄抗TMV、CMV、疫病、疮痂病和根结线虫病及田间诱导大白菜抗霜霉病的活性进行了研究,并且对BABA诱导辣椒抗病性的机理从酶（PR蛋白）活性及基因表达水平进行了研究。主要结果如下:1.β-氨基丁酸（BABA）喷雾处理辣椒叶片和茎秆后可诱导辣椒获得对TMV和CMV的抗性,并且BABA诱导茄门、931和21号等3个辣椒品种对TMV的抗性效果相同,其差异不明显;BABA的诱抗效果受诱抗剂的使用浓度所影响,诱导辣椒抗TMV的最佳处理浓度为1000μg/mL,并且对植株没有药害作用。2.茄门、931和21号等3个辣椒品种在BABA处理3d后即可产生对TMV的抗性,随着时间的推移,其抗性随之增高,BABA在第5～6d诱抗效果达到最高,之后开始下降,其持效期可达15d以上;随着生育期的增长,3种诱抗剂对甜辣椒的诱抗效果也随之增强,4叶期时,诱抗效果都相对较低:BABA诱导8叶期辣椒抗TMV的效果曲线呈现高-低-高的趋势;TMV接种浓度越高,BABA诱导辣椒抗TMV的效果越好。3.β-氨基丁酸（BABA）、茉莉酸（JA）及其甲酯（MeJA）喷雾处理辣椒叶片和茎秆后可诱导辣椒获得对TMV的抗性,三种诱抗剂对不同辣椒品种所表现的诱抗效果没有显著差异,最高的诱抗效果可达到50%以上;BABA、JA及等浓度混合溶液分别喷洒于6叶期茄门、931、21号辣椒植株的结果证明,1000μg/mL的BABA、JA及混合液在茄门上的诱抗效果分别为42.2%、35.2%和36.7%:对931的分别为34.9%、42.8%和44.5%;21号为46.2%、39.6%和43.6%,等浓度混合溶液的诱抗效果介于BABA和JA之间,说明BABA与JA既不可能存在拮抗作用,也不可能存在增效作用。4.10%BABA可溶性粉剂对多种病害的诱抗效果均在BABA纯剂之上,特别是对辣椒疫病的诱抗效果在接种后10d仍高达88%;对大白菜抗霜霉病的诱抗效果也较生产上常用药剂甲霜锰锌要好。BABA衍生物对TMV、CMV、疫病和根结线虫病亦表现出一定的诱抗潜能。5.对β-氨基丁酸诱导辣椒后叶片中β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和过氧化物酶活性的动态变化进行测定,结果表明,BABA对不同抗、感辣（甜）椒β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶活性和过氧化物酶活性有不同程度的提高,但辣椒品种这3种PR蛋白酶活性升高的幅度高于甜椒品种;而且这三种PR蛋白活性变化与诱抗效果的表现相一致。6.BABA可以诱导几丁质酶ClassⅢ和脂氧合酶基因的表达,诱导处理辣椒后,几丁质酶ClassⅢ和脂氧合酶基因的表达都呈现低-高-低的抛物线型的发展趋势,6h时表达量较小或不表达,大多在12～24h间表达量达到最大,之后表达开始减弱,到48h基本停止表达或微弱表达。对所得差异片段进行了核苷酸序列同源性分析,发现与已经报道的辣椒的脂氧合酶的编码序列高度同源,同源性达到99%～100%。7.P450在植物体中担当着生物合成和代谢解毒两大类型功能,其中有一些P450在植物防御反应中具有重要的作用。用RT-PCR和RACE方法,从β-氨基丁酸（BABA）诱导辣椒叶片的基因表达体系中克隆出CYP92A的全长cDNA序列。生物信息学表明,该基因编码一条509个氨基酸残基的多肽,含有一段细胞色素P450保守的血红素结合区域。在二级结构上,该基因编码的蛋白质与已报道细胞色素P450的晶体结构相似。从而,CYP92A被确定是细胞色素P450。通过系统进化分析,CYP92A属于多基因家族P450的92A亚家族。结合己报道的92A亚家族成员的信息,推测CYP92A参与了植物的防御反应。β-氨基丁酸能够诱导辣椒对病毒病、细菌病害、真菌病害及线虫病害都具有较好的抗性,其抗性的产生与相关基因的表达及病程相关蛋白的产生有关。同时,BABA还能诱导辣椒叶片的细胞色素P450基因表达。本研究结果为BABA诱导机理的最终阐明提供了新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 作物诱导抗病性研究进展
• 1.1 具诱导作物抗病作用的活性因子
• 1.2 诱导抗病作用机制
• 2 β-氨基丁酸诱导植物抗病作用及其机理
• 2.1 BABA在植物抗病性中的作用
• 2.2 BABA诱导植物抗病的作用机制
• 2.3 BABA的使用方法及在植株体内的吸收、运转和代谢
• 2.4 BABA结构与功能的关系
• 2.5 展望
• 3 细胞色素P450表达在植物防御反应中的作用
• 3.1 P450基因的多样性与植物的抗病性
• 3.2 P450在寄主-病原物互作中的表达
• 3.3 P450在植物抗病反应的作用途径
• 3.4 结束语
• 4 选题依据与技术路线
• 4.1 选题依据
• 4.2 技术路线
• 第二章 β-氨基丁酸诱导植物抗病作用的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 BABA诱导番茄抗线虫的作用
• 2.2 BABA诱导作物抗真菌病的作用
• 2.3 BABA诱导作物抗细菌病的作用
• 2.4 10%BABA可溶性粉剂诱导抗病性试验
• 2.5 BABA诱导作物抗病毒病的作用
• 3 讨论
• 第三章 β-氨基丁酸诱导辣椒抗病机理的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 2.2 BABA诱导对β-1,3-葡聚糖酶活性的影响
• 2.3 BABA诱导对几丁质酶活性的影响
• 2.4 BABA诱导对过氧化物酶活性的影响
• 2.5 BABA处理后茄门叶片的DD-PCR分析
• 2.6 序列分析及同源性比较
• 3 讨论
• 第四章 β-氨基丁酸诱导辣椒细胞色素P450基因的克隆及其表达分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA的提取结果
• 2.2 BABA处理后辣椒叶片的RT-PCR分析
• 2.3 辣椒CYP92基因全长cDNA序列的克隆
• 2.4 序列分析
• 3 讨论
• 第五章 主要结论与创新之处
• 1 主要结论
• 2 创新之处
• 参考文献
• 附录
• 附录一 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 附录二 碱裂解法细菌总DNA小量提取
• 附录三 培养基
• 附录四 试剂与溶液
• 2法感受态细胞制备及转化'>附录五 大肠杆菌CaCl₂法感受态细胞制备及转化
• 附录六 缩略语表
• 个人简历
• 致谢