盾叶薯蓣遗传多样性及多倍体新种质培育的研究

论文摘要

我国特有种盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C．H．Wright）根茎中薯蓣皂苷元含量高，是提取甾体激素类药物的重要药源植物。目前，栽培种源混乱，种质退化，低含、低产，遗传背景不清，缺乏优良品种。为此，本研究从其资源调查入手，利用RAPD技术对其遗传多样性及系统分类学进行了研究。并通过倍性诱变技术，培育出高含、高产、遗传性状稳定的同源四倍体新种质XHJ—401，建立了其离体快繁技术体系，对其生物学与农艺学特性及生理生化特性进行了研究，并与AK杂交获得了杂交种子。主要研究结果叙述如下：（1）以TY雄株为起始材料，通过离体化学诱变获得了同源四倍体染色体为2n=2x=40。其一、二年生试管苗根茎平均产量分别为7.87725×103kg·hm-2和8.70558×104kg·hm-2，较其2n试管苗（2N）分别高141％和373.11％；一、二年生根茎薯蓣皂苷元平均含量分别为1.601％和2.966％，后者较2N和TY分别高255.21％和81.30％；其光合作用、呼吸作用、叶片叶绿素含量、气孔器及保卫细胞大小、保卫细胞叶绿体数量及大小、POD及CAT活性均高于2n亲本，田间的适应性及营养生长也强于2n，生育期较之长37～40d，达306d～310d；性状稳定；具有高产及高抗的形态结构与生理生化基础。与AK杂交，获得杂交种子的染色体为2n=3x=30；花药培养所获愈伤的染色体为n=1x=10。（2）对其形态学多样性进行研究。发现了自然六倍体（2n=6x=60）和四倍体（2n=4x=40）；首次发现盾叶薯蓣有多胚现象，可能具有无融合生殖；发现有雌雄异株、雌雄同株或同序、杂性同株或异株及具不育雄蕊的两性花；自然性比：雄株：雌株：雌雄同株及同序=54：44：2；发现了块茎状根状茎、长棍状根状茎，异形叶性，叶脉凹陷型叶片；观察到其花序是莱荑花序而不是穗状花序；各种群器官形态变化因种群、个体、所处部位及立地环境不同而存在明显差异。（3）对其生物学和农艺学特性进行研究时发现，其雄株、雌株、雌雄同株三者可以自然相互转换，变性率：XHJ-401（12.69％）＞2N（10.83％）＞TY（10％）；具有单性结实现象，结实率：XHJ-401（36.4％）＞AK（8.2％）。具耐荫植物特点。薯蓣皂苷元含量与多个形态指标具有相关；根状茎断面颜色不能作为含量的形态标记，但在同一种质之内比较可行；根据保卫细胞宽度能快速准确地进行倍性形态学鉴定。（4）对盾叶薯蓣种群进行了RAPD遗传多样性、遗传结构的比较研究，提出盾叶薯蓣为遗传多样性较高、Gst相对偏小而Nm相对较大的亚狭域种。主要结果如下：①从60条随机引物中筛选出条带清晰可辨、多态性表现较为丰富的20个引物，对52份供试材料进行RAPD PCR扩增，共扩增出385条DNA带，其中220条为多态带，PPB=57.14％。②利用POPGENE 1.32软件进行遗传多样性分析表明，盾叶薯蓣的Nei’s h=0.4737，Shannon I=0.6666，具较大的遗传多样性；在薯蓣属6个种中的遗传多样性最高。其遗传多样性大小及其顺序为：种间（h=0.4767，I=0.6697）≥种内≥种群间（0.4737，0.6666）≥种群内（0.4328～0.4829，0.6310～0.6758）≥世代间的（0.4500，0.6414）≥亲本世代（AK：0.4496，0.6410）≥F1代的（AK F1：0.4409，0.6308）。种群内遗传多样性相对丰富，但各种群的遗传多样性存在明显差异，江南种群＞江北种群。③种间Gst=0.0709＞种群间Gst（0.0390）＞世代间Gst（0.0075）。薯蓣属种内分子变异大种间分子变异小；盾叶薯蓣种群内、世代内的分化大，种群之间、世代之间的分化小。④盾叶薯蓣世代间Nm（66.5163）＞种群间Nm(12.3071＞种间Nm（6.5516）；其种群间Nm大，但不同种群Nm有所不同，差别较大。⑤Nei’s遗传距离D值大小及顺序为：纤细薯蓣（0.0289）＜叉蕊薯蓣（0.0612）＜柴黄姜（0.0651）＜薯蓣（0.0733）＜黄独（0.0782）；盾叶薯蓣各种群间D=0.0067～0.1575。薯蓣属3组6种之间：D=0.0289～0.1105，遗传一致度I=0.9248～0.9715；根状茎组3种之间的D值最小，与基生翅组黄独间的D值最大。XHJ-401与2N及TY亲本之间的D值分别为0.0350和0.0333，发生了较大的遗传分异。（5）盾叶薯蓣种群UPGMA聚类分析结果显示，染色体倍性相同，则遗传距离相近，因而来源不同但倍性相同的类群能较早聚为一类，构成种群复合体（新提概念）。倍性变化产生的遗传分异大于地理隔离和种群扩散距离，高山的遗传隔离作用较江河的大。染色体加倍，造成了形态学表型及NDA分子的较大差异，因而提出其多倍体生物学效应并非来源于简单的DNA量的累加效应的观点。（6）建立了盾叶薯蓣种内分子分类系统，提出了根状茎组→周生翅组→基生翅组薯蓣属组间进化新观点；首次以分子证据证明了根状茎组为一个自然类群。（7）绘制了盾叶薯蓣资源水平分布图，发现其两个主要分布区并不明显连续；认为其种群扩散路线是沿长江及其支流由西向东、并在长江中游再分支向南、向北迁移，形成以湘西和鄂西北为中心的两个新的分布亚中心。提出其种群扩散的主要阻遏因素不是大江而是高山的新观点。本种分布于多种乔木林、灌丛及草丛群落中；自然分布率：灌丛（50.2％）＞乔木林（34.6％）＞草丛（15.2％）；郁闭度3～5时的分布率分别高达48.4％、55.6％、45.2％。

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摘要

ABSTRACT

第一章前言

1 文献综述

1.1 盾叶薯蓣研究进展

1.1.1 盾叶薯蓣的主要用途

1.1.2 甾体激素药物及其药源植物的研发

1.1.2.1 甾体化合物结构和种类

1.1.2.2 甾体激素药物的用途

1.1.2.3 薯蓣皂苷元高含植物的探寻

1.1.2.4 薯蓣皂苷元生产与甾体激素的合成

1.1.3 分类学研究

1.1.4 细胞染色体研究

1.1.5 组织与细胞培养及同源四倍体诱导研究

1.1.6 盾叶薯蓣的生态分布及植物资源学研究

1.1.7 引种驯化栽培与繁殖研究

1.1.8 盾叶薯蓣生物多样性及种质研究

1.1.9 盾叶薯蓣其他方面的研究

1.2 遗传多样性研究进展

1.2.1 遗传多样性概念及其研究意义

1.2.2 遗传多样性产生的基础研究

1.2.3 种群遗传多样性的评价指标研究

1.2.3 分子生物学技术在遗传多样性研究中的应用

1.2.4 RAPD技术及其在遗传多样性研究中的应用

1.2.4.1 RAPD技术的基本原理及技术特点

1.2.4.2 RAPD在种质资源遗传亲缘关系研究中的应用

1.2.4.3 基于RAPD的植物遗传多样性研究

1.3 倍性诱变及多倍体育种研究进展

1.3.1 倍性诱变及多倍体育种原理与方法

1.3.2 药用植物多倍体育种研究

1.3.3 花药培养与单倍体育种研究

2 立题的依据和意义

3 研究的主要内容与目的

3.1 主要内容

3.2 主要目的

第二章盾叶薯蓣的资源调查及形态多样性研究

1 方法

1.1 盾叶薯蓣的分布及群落多样性调查方法

1.2 盾叶薯蓣器官形态多样性研究方法

1.3 盾叶薯蓣染色体多样性研究方法

1.3.1 材料处理

1.3.2 试剂配制

1.3.3 染色体标本制作与观察

2 结果与分析

2.1 盾叶薯蓣的分布及种群扩散

2.2 盾叶薯蓣生境的多样性

2.2.1 植被多样性

2.2.2 群落多样性

2.2.2.1 群落类型

2.2.2.2 盾叶薯蓣在群落中的分布

2.3 根与茎的形态多样性

2.3.1 地上茎的形态多样性

2.3.2 地下茎及根的形态多样性

2.4 叶的形态多样性

2.5 花、花序及花性的形态多样性

2.6 果实、种子与胚的多样性

2.7 染色体的多样性

2.7.1 染色体数目

2.7.2 染色体形态

3 讨论

3.1 盾叶薯蓣分布与种群扩散及薯蓣皂苷元含量的关系

3.2 盾叶薯蓣的形态多样性与薯蓣皂苷元含量的关系

3.3 种群染色体数目与进化、薯蓣皂苷元含量的关系

第三章盾叶薯蓣遗传多样性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料及其来源

1.1.2 材料处理

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器

1.2.1.1 主要生化试剂

1.2.1.2 主要仪器设备

1.2.2 实验方法或操作程序

1.2.2.1 供试材料基因组DNA的提取与纯化

1.2.2.2 DNA的检测

1.2.2.3 RAPD扩增反应及条件优化

1.2.2.4 遗传多样性RAPD分析

1.2.2.5 系统分类学研究方法

2 结果及分析

2.1 基因组总DNA的质量与产量检测结果

2.2 RAPD反应条件比较

2.2.1 模板浓度对RAPD反应的影响

2.2.2 引物浓度对RAPD反应的影响

2.2.3 Mg2+的浓度对RAPD反应的影响

2.2.4 dNTP浓度对RAPD反应的影响

2.2.5 Taq DNA聚合酶对RAPD反应的影响

2.2.6 扩增循环数对RAPD反应的影响

2.2.7 退火温度对RAPD反应的影响

2.3 遗传多样性RAPD分析

2.3.1 随机引物筛选结果

2.3.2 PCR扩增结果

2.3.3 RAPD扩增产物的多态性

2.3.4 盾叶薯蓣遗传多样性分析

2.3.4.1 盾叶薯蓣与同属其它种的遗传多样性比较

2.3.4.2 盾叶薯蓣不同种群的遗传多样性比较

2.3.4.3 盾叶薯蓣几个种群内的遗传多样性比较

2.3.5 盾叶薯蓣的遗传分化比较

2.3.5.1 种群间与种群内的基因分化

2.3.5.2 盾叶薯蓣的基因分化与多样性总体比较

2.4 分子系统分类学探讨

2.4.1 遗传距离

2.4.1.1 种间遗传距离

2.4.1.2 盾叶薯蓣种群间的遗传距离

2.4.2 聚类分析

2.4.2.1 盾叶薯蓣种群聚类分析

2.4.2.2 盾叶薯蓣与同属植物的种间聚类分析

2.4.3 RAPD分子系统分类学结果

2.4.3.1 盾叶薯蓣种内系统分类学处理

2.4.3.2 薯蓣属6个种的分组系统分类学处理

3 小结与讨论

3.1 RAPD—PCR反应

3.1.1 不同提取方法及实验条件对盾叶薯蓣DNA提取的影响

3.1.2 RAPD反应体系

3.1.2.1 各反应参数对RAPD反应的影响

3.1.2.2 RAPD稳定程度的可控性

3.2 RAPD遗传多样性分析

3.2.1 随机引物及供试材料对RAPD-PCR扩增结果的影响

3.2.2 分类等级与遗传多样性的关系

3.2.3 种群遗传多样性的差异及其影响因素

3.2.4 种群及世代的遗传多样性差异及其影响因素

3.2.5 种群间基因分化的原因及其与遗传多样性的关系

3.2.6 多倍体NDA分子及基因表达差异的原因

3.2.7 遗传分化与遗传多样性保护

3.3 分子系统分类学方法的选择及其可靠性

3.4 聚类分析及分子系统分类学结果的解析

3.4.1 种上分类等级及其进化路线处理的适用性分析

3.4.2 种下分类群划分的解析

第四章薯蓣皂甙元含量的HPLC测定及其比较研究

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器与试剂

2 方法与结果

2.1 含水量测定

2.2 薯蓣皂苷元含量测定

2.2.1 色谱条件

2.2.2 标准品溶液配制

2.2.3 样品溶液的制备

2.2.4 线性关系的考察

2.2.5 样品的测定

2.2.6 回收率实验

3 结论与分析讨论

3.1 薯蓣皂苷元含量的测定方法

3.2 薯蓣皂苷元含量的比较

第五章盾叶薯蓣的倍性诱变研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 盾叶薯蓣二倍体离体再生体系的建立方法

1.2.1.1 材料处理

1.2.1.2 培养基的制备

1.2.1.3 盾叶薯蓣二倍体愈伤组织的诱导

1.2.1.3.1 外植体的接种及培养条件

1.2.1.3.2 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响

1.2.1.3.3 不同外植体的愈伤组织诱导效果比较

1.2.1.3.4 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响

1.2.1.4 不同植物生长调节剂浓度组合对愈伤组织分化的影响

1.2.1.5 不同因素与水平组合对类原球茎生根的影响

1.2.1.6 二倍体试管苗的炼苗与移栽

1.2.2 盾叶薯蓣四倍体的诱导及其鉴定

1.2.2.1 离体诱变培养体系的建立

1.2.2.2 利用秋水仙素诱导四倍体植株

1.2.2.3 四倍体植株的鉴定

1.2.3 盾叶薯蓣花药培养及其鉴定

1.2.3.1 外植体的接种及培养条件

1.2.3.2 花药愈伤组织的诱导和增殖

1.2.3.3 花药愈伤组织的分化

2 结果与分析

2.1 盾叶薯蓣二倍体离体再生体系的建立

2.1.1 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响

2.1.2 不同基因型外植体对愈伤组织诱导的影响

2.1.3 不同部位外植体对愈伤组织诱导的影响

2.1.4 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响

2.1.5 不同植物生长调节剂浓度组合对愈伤组织分化的影响

2.1.6 不同因素组合对试管苗生根的影响

2.1.7 二倍体试管苗的炼苗与移栽

2.2 盾叶薯蓣四倍体的诱导及其鉴定

2.2.1 不同处理方式对盾叶薯蓣四倍体诱变率的影响

2.2.1.1 浸泡法对四倍体诱变率的影响

2.2.1.2 混培法对四倍体诱变率的影响

2.2.1.3 点滴法对四倍体诱变率的影响

2.2.2 四倍体植株的形态学鉴定

2.3 盾叶薯蓣花药培养单倍体愈伤组织的诱导及其分化

2.3.1 基本培养基对愈伤组织诱导的影响

2.3.2 不同浓度的蔗糖对愈伤组织诱导的影响

2.3.3 光培养和暗培养对愈伤组织诱导的影响

2.3.4 固体和液体培养基对愈伤组织诱导的影响

2.3.5 不同植物生长调节剂浓度组合对愈伤组织诱导的影响

2.3.6 愈伤组织的分化

2.4 盾叶薯蓣不同倍性植株染色体的鉴定

2.4.1 染色体数目检测

2.4.2 倍性诱导稳定性实验

3 讨论

3.1 盾叶薯蓣组织培养和植株再生体系的建立

3.1.1 不同基本培养基对盾叶薯蓣组织培养的影响

3.1.2 不同外植体对盾叶薯蓣组织培养的影响

3.1.3 不同植物生长调节剂种类与浓度对盾叶薯蓣组织培养的影响

3.2 盾叶薯蓣多倍体的诱导

3.2.1 不同秋水仙素处理方法对染色体多倍性的影响

3.2.2 嵌合体现象

3.3 影响单倍体的诱导的因素

第六章盾叶薯蓣四倍体新种质"XHJ-401"快速繁殖体系的建立

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 外植体的接种及培养条件

1.2.2 愈伤组织的诱导和增殖

1.2.3 类原球茎的分化与增殖

1.2.4 类原球茎及其植株的个体生长

1.2.5 带类原球茎植株的生根

1.2.6 带类原球茎试管苗的炼苗与壮苗

2 结果与分析

2.1 不同外植体在不同植物生长调节剂配比培养基上培养效果比较

2.2 不同植物生长调节剂浓度组合对致密愈伤组织形成的影响

2.3 不同植物生长调节剂浓度组合对类原球茎诱导的影响

2.4 类原球茎在分化增殖培养基上的生长

2.5 不同因素组合对类原球茎生根的影响

2.6 带类原球茎试管苗的炼苗与壮苗

2.6.1 类原球茎的生长发育

2.6.2 人工气候箱炼苗实验

2.6.3 温室炼苗与壮苗实验

2.7 盾叶薯蓣四倍体离体培养快速繁殖技术体系

3 讨论

3.1 不同外植体与愈伤组织诱导及类原球茎分化的关系

3.2 6-BA和2,4-D在愈伤组织诱导和增殖中的作用

3.3 6-BA、KT和蔗糖对类原球茎诱导的影响

3.4 类原球茎生根培养中各因素的影响

3.5 温度、湿度与栽培基质对试管苗炼苗与壮苗的影响

3.6 四倍体盾叶薯蓣离体培养快速繁殖技术体系的可行性

第七章盾叶薯蓣四倍体新种质"XHJ-401"生物学特性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 物候及其生长发育特性比较观察方法

1.2.2 器官形态学及生长性能比较方法

1.2.3 叶表皮及保卫细胞叶绿体显微与超微结构比较方法

1.2.3.1 仪器及药剂

1.2.3.2 方法与步骤

1.2.4 栽培与杂交方法

1.2.4.1 栽培及根茎产量与薯蓣皂苷元含量测定方法

1.2.4.2 杂交试验方法

2.结果

2.1 四倍体与二倍体物候学比较观察

2.2 四倍体与二倍体器官形态学及生长性能比较

2.2.1 根的形态学及生长性能比较

2.2.2 地上茎的形态学及生长特性比较

2.2.3 根状茎的形态学及生长性能比较

2.2.4 叶的形态学比较

2.2.5 花的形态学及变性率比较

2.2.6 果实与种子的形态学比较

2.3 四倍体与二倍体组织与细胞形态结构比较

2.3.1 叶表皮及气孔器的显微形态结构比较

2.3.1.1 表皮细胞及气孔器的密度

2.3.1.2 气孔器大小

2.3.2 叶下表皮及气孔器的显微形态结构观察

2.3.3 保卫细胞叶绿体的超微形态结构比较

2.4 盾叶薯蓣四倍体新种质"XHJ-401"的栽培与杂交

2.4.1 XHJ-401的根茎产量

2.4.2 XHJ-401的根茎含水量与薯蓣皂苷元含量

2.4.3 四倍体XHJ-401与二倍体AK的杂交

3 分析与讨论

3.1 四倍体与二倍体物候学比较观察

3.2 四倍体与二倍体器官形态学比较

3.3 四倍体与二倍体叶表皮及气孔器的显微形态结构比较

3.3.1 气孔器密度、大小与环境的关系及倍性鉴定

3.3.2 叶下表皮及气孔器的显微形态与倍性鉴定

3.4 保卫细胞叶绿体的超微形态结构与光合作用的关系

第八章盾叶薯蓣四倍体新种质"XHJ-401"生理生化特性研究

1 材料与仪器及方法

1.1 材料

1.1.1 光合特性研究材料

1.1.2 叶片叶绿体色素含量及其酶活性研究材料

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

1.2.2 试剂

1.3 方法

1.2.1 光合特性测定

1.2.2 叶绿体色素含量测定

1.2.2.1 色素的提取

1.2.2.2 吸光度的测定

1.2.2.3 各色素含量的计算

1.2.3 过氧化物酶活性测定

1.2.3.1 试剂配制

1.2.3.2 实验步骤

1.2.3.3 计算方法

1.2.4 过氧化氢酶活性的测定方法

2 结果与分析

2.1 光合特性研究

2.1.1 不同倍性盾叶薯蓣之间的光合速率比较

2.1.2 二倍体不同种群之间的光合速率比较

2.2 叶绿体色素含量

2.3 XHJ-401的过氧化物酶活性

2.4 XHJ-401的过氧化氢酶活性

3 分析与讨论

3.1 盾叶薯蓣的光合特性

3.2 叶绿体色素含量

3.3 过氧化物酶活性

3.4 过氧化氢酶活性

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