黄河兰州段环境激素污染水平及有机污染物的细胞毒性研究

论文摘要

随着水体有机污染的日益加重,近年来水体中微量有机污染物愈来愈为人们所关注。环境激素（environmental hormone, EH）是指外源性干扰生物体内分泌的化学物质,这些物质可模拟体内的天然激素,与激素的受体结合,影响本来身体内激素的量,以及使身体产生对体内激素的过度作用；或直接刺激,或抑制内分泌系统,使内分泌系统失调,进而阻碍生殖、发育等机能,甚至有引发恶性肿瘤与生物绝种的危害。近年来,环境激素日益引起学术界的关注,许多研究机构和政府组织也开始高度重视环境激素的问题。本文通过对黄河兰州段及其一级支流不同断面水体中环境激素污染水平的分析以阐明该水体中环境激素的容量及分布,探明环境激素的来源和污染途径,并确定环境激素污染对环境生态和人体健康可能造成的影响,以及应采取的控制措施。同时,采用固相萃取法对黄河水中有机污染物进行提取,以体外细胞染毒培养的方法,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长、细胞周期和凋亡的影响；探讨其对MCF-7细胞端粒酶表达的影响；检测有机污染物作用于MCF-7后细胞内游离钙离子的浓度（[Ca2+]i）,观察细胞内Ca2+浓度对细胞凋亡的影响。通过固相萃取（SPE）和气相色谱与质谱联用技术（GC-MS）.气相色谱法（GC-FID）等对黄河兰州段及其一级支流不同断面水体中有可能存在的有机污染物及有机类环境激素进行了定性、定量分析；采用原子吸收法和原子荧光法对镉、铅、汞三种已经确认的重金属类环境激素进行了定性定量分析；用噻唑蓝（MTT）比色法检测不同断面有机污染物在细胞培养48h的IC50。并利用流式细胞仪检测有机污染物对MCF-7细胞周期和细胞凋亡的影响；对细胞端粒酶活性表达水平利用PCR-TRAP法进行检测；细胞内[Ca2+]i的浓度采用激光共聚焦显微镜法检测。结果表明：（1）定性分析检测出黄河兰州段水体中含有有机物89种,其中,属美国EPA优先控制的污染物6种、中国环境优先控制污染物6种。（2）黄河兰州段水体中定性检测出环境激素类有机物10种,其中,属已确认的环境激素5种,包括萘、菲、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基已基）酯（DEHP）、苯并噻唑,其检出概率分别达20%、40%、100%、100%、20%。（3）各主要断面四种环境激素浓度有差异,萘、菲、DBP、DEHP的浓度分别在0.180-0.260、0.117-0.320、1.480-13.890、1.040-109.930ug.L-1之间；有部分断面的菲、DBP、DEHP超过国家《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）和美国EPA（1991）水质标准。（4）所有断面汞、镉均低于检测限,而铅在各断面均检出,浓度在0.012-0.032mg·L-1之间,仅符合国家《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）Ⅲ类标准。（5）黄河兰州段水体中有机污染物影响MCF-7细胞的生长增殖。选择黄河兰州段污染断面（中山桥）、自净断面（什川桥）和清洁断面（新城桥）三个断面采集水样,SPE法富集提取水样中的有机污染物,计算得各断面水体中有机污染物的浓度分别为0.58mg·L-1、0.45mg·L-1、0.33mg·L-1;三个断面水样中有机污染物分别作用于MCF-7细胞48h后,MTT法检测结果表明,在0-0.50mg.m1-1范围内,三个断面有机污染物作用的各个组其细胞增殖抑制率（CPIR）值很小,各组之间变化不明显,说明在此浓度范围内细胞生长增殖基本不受有机污染物的影响；在1.00-5.00mg·L-1范围内,各组细胞增殖抑制率均高于对照组（p<0.01）；不同断面各浓度组中,污染断面的细胞增殖抑制率最高；经相关性分析,MCF-7细胞的CPIR与各断面的有机污染物浓度呈明显正相关（p<0.01）,相关系数分别为0.903、0.766、0.820,计算得污染断面、自净断面和清洁断面的IC50分别为3.37±0.02mg·ml-1、4.03±0.01mg·ml-1、4.34±0.03mg·ml-1,表明剂量相同时,污染断面有机物对乳腺癌细胞的抑制作用更强。在有机物剂量为10.00-40.OOmg·ml-1时,各断面有机污染物对细胞的增殖抑制出现饱和,且随剂量的增加,其CPIR逐渐下降,其中,污染断面更加显著（p<0.01）（6）黄河兰州段水体中有机污染物影响MCF-7细胞的周期和凋亡。流式细胞检测仪检测分析表明,各断面的有机污染物作用于MCF-7细胞48h后,各个组的细胞凋亡率明显高于对照组,且污染断面与对照组相比差异显著（p<0.01）；细胞凋亡率由高到低依次为污染断面31.43±3.00%、清洁断面17.63±0.47%、自净断面13.37土1.43%和对照组8.10±0.25%,单因素方差分析表明,三个组相互比较均有统计学意义（p<0.05）；各断面各浓度组的细胞周期分布为G1期细胞均值百分比由高到低依次为清洁断面84.47±1.67%、自净断面77.86±0.14%、污染断面55.03±3.63%,各断面百分比均大于55%,表明细胞主峰在G1期积聚。（7）黄河兰州段水体中有机污染物影响MCF-7细胞端粒酶活性的表达。通过TRAP-PCR技术检测细胞端粒酶的活性,发现各断面有机污染物染毒乳腺癌细胞24h、48h、72h时,不同浓度不同时点的端粒酶灰度值与对照组相比有统计学意义（p<0.01）；随着染毒处理时间的延长,各染毒组及相应对照组的端粒酶灰度值均逐渐降低,呈现时间依赖性（p<0.05）。（8）利用激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙离子（[Ca2+]i）的浓度发现,[Ca2+]i在细胞凋亡的信号转导通路中具有重要的作用。各断面各浓度组有机污染物分别作用于MCF-7细胞24h、48h和72h后,各浓度组在不同时点细胞内[Ca2+]i浓度均升高,即其荧光强度值高于对照组；各组随有机污染物染毒时间的延长,细胞内钙离子浓度呈下降趋势,具有时间—效应关系。为检测钙离子的来源,检测时将无钙缓冲液换成含钙缓冲液,结果在不同时点上无钙离子组和含钙离子组间均有显著性差异（p<0.05）。抑制了细胞质内钙离子浓度的增加,提示钙离子浓度增加与外钙无关。通过以上研究,可以得出如下结论：（1）黄河兰州段有机物污染较重,共检出89种有机物,其中10种环境激素类污染物,6种美国EPA优先控制污染物,6种中国优先控制污染物,其主要来源为石油化学工业。（2）黄河兰州段水体中有机类环境激素主要是邻苯二甲酸酯类,无机类主要是铅。（3）对照断面上游污染也较严重,湟水对黄河兰州段整体污染有重要贡献；饮用水水源断面污染相对较小；其它各断面的污染状况更加不容乐观。（4）黄河兰州段水体中有机污染物在中剂量以上时抑制MCF-7细胞增殖,并诱导其凋亡。（5）在中剂量时,黄河兰州段水体中有机污染物抑制MCF-7细胞端粒酶的活性；随染毒时间的延长,抑制作用逐渐下降。（6）各断面水体中有机污染物能够诱导MCF-7细胞内[Ca2+]i浓度增加,且随作用时间的延长其诱导[Ca2+]i浓度增加的效果减弱。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 水体中有机污染物研究现状
• 2 环境激素的研究概况
• 3 黄河水污染现状
• 4 环境激素水污染研究现状
• 5 水中有机污染物的固相萃取技术
• 6 细胞周期和细胞凋亡
• 7 端粒酶与肿瘤细胞
• 2+]I)浓度与细胞凋亡'>8 细胞内游离钙离子([CA²⁺]I)浓度与细胞凋亡
• 9 本项目拟解决的问题和研究方法
• 第一部分 黄河兰州段水体中环境激素污染水平分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 黄河兰州段水体中有机污染现状分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 水体中有机污染物对细胞周期及细胞凋亡的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四部分 水体中有机污染物对乳腺癌细胞端粒酶活性的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第五部分 水体中有机污染物对细胞内钙离子浓度的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 第六部分 本研究的总结和展望
• 1 总结
• 2 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 攻读学位期间发表的论文
• 攻读学位期间出版的著作、教材
• 攻读学位期间主持和参与的课题
• 致谢
• 附录
• 附录1 英文缩略语
• 附录2 美国环保局优先控制污染物
• 附录3 中国环境优先控制污染物"黑名单"