商陆高亲和性K+转运体基因PaHAK1的克隆及其功能的初步分析

论文摘要

商陆是迄今为止筛选出来的含钾量最高的植物之一,其能在K+浓度极低（微摩尔水平）的土壤中正常生长,究其原因可能就是高亲和性K+转运体（PaHAK）的高表达或高效转运所致。为了研究高钾植物商陆高亲和K+吸收机制,本项目以商陆为材料,基于同源克隆及RACE技术克隆到商陆PaHAK1基因,将其在水稻日本晴和钾吸收缺陷型酵母突变体W△6中进行过量表达,综合基因表达分析、钾离子吸收动力学分析及生物信息学分析结果初步确定PaHAK1基因的功能。得到如下的结果：（1）比较了商陆和水稻的吸钾动力学参数,结果显示在不同K+浓度处理下,Km. Cmin和max均发生显著的变化。在低K+浓度下,商陆的Cmin和Km值都相对较小,而max值较大,这种差异随着K+浓度的升高而变小。说明商陆在低钾条件下,相对水稻而言具有更高的K-+的吸收或转运能力。（2）克隆到PaHAK1基因序列,其cDNA全长为2337 bp,编码771个氨基酸。该编码蛋白质分子量为86.66 KDa,等电点为7.54。蛋白质疏水性和拓扑结构分析显示该氨基酸序列共有12～13个跨膜区。该cDNA序列与冰叶日中花HAK1基因序列相似性高达88%。（3）用Real-Time PCR研究了PaHAK1基因在商陆不同器官中和在不同K+浓度处理下的表达模式。结果显示,PaHAK1的表达存在空间差异,其在根部的表达最高；低钾（缺钾）条件下能够诱导PaHAK1在根中的高表达,随着外界K+浓度的增加,基因的相对表达量逐渐降低,推测PaHAK1就是一个与K+吸收相关的高亲和性K+转运体。（4）构建了PaHAK1的过表达载体,用农杆菌介导的快速遗传转化方法转化日本晴。PCR检测结果表明,得到25个阳性转基因水稻株系。（5）在pYPGE15基础上构建PaHAK1基因过表达载体,通过电激转化的方法将PaHAK1转入到钾离子吸收缺陷型酵母突变体W△6中,为进一步验证PaHAK1功能奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1 钾素及我国钾营养现状
• 1.1 钾素生理功能
• 1.2 我国土壤和作物钾营养的现状
• +转运体相关蛋白研究'>2 植物K⁺转运体相关蛋白研究
• 2.1 植物对钾的吸收与转运
• 2.2 植物钾吸收与转运相关蛋白
• 2.3 野生高钾植物商陆
• 3 本研究目的与意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 缓冲液
• 1.4 酶和试剂
• 1.5 主要实验仪器设备
• 2. 试验方法
• 2.1 植物材料的培养
• 2.1.1 植物种子预处理及催芽
• 2.1.2 植物幼苗培养
• 2.2 商陆吸钾动力学测定
• 2.2.1 样品的收集
• 2.2.2 钾含量的测定与分析
• 2.3 PaHAK1基因的克隆
• 2.3.1 引物的设计与PCR
• 2.3.2 商陆组织RNA的提取
• 2.3.3 DNaseⅠ酶处理
• 2.3.4 cDNA第一链的合成
• 2.3.5 3′非编码区的扩增
• 2.3.6 PaHAK1的扩增
• 2.3.7 PCR产物的T-A克隆
• 2.3.8 目的基因的鉴定
• 2.4 PaHAKl基因表达分析
• 2.4.1 引物的设计
• 2.4.2 内参的确定
• 2.4.3 Real-Time PCR
• 2.5 分析方法
• 2.6 PaHAK1过表达载体的构建
• 2.6.1 EHA105感受态细胞的制备
• 2.6.2 过表达载体的构建
• 2.7 农杆菌介导的水稻快速转化
• 2.7.1 农杆菌的转化
• 2.7.2 种子的处理,接种及愈伤组织的诱导
• 2.7.3 浸染液的制备
• 2.7.4 愈伤组织的浸染和共培养
• 2.7.5 抗性愈伤的筛选
• 2.7.6 分化
• 2.7.7 生根培养
• 2.7.8 炼苗及成苗后的移栽
• 2.8 转基因植株的分子检测
• 2.8.1 水稻叶片总DNA的提取
• 2.8.2 转基因植株的PCR检测
• 2.9 酵母真核表达载体的构建
• 2.9.1 引物设计和PCR
• 2.9.2 PCR反应体系
• 2.9.3 PaHAK1的T-A克隆
• 2.9.4 真核表达载体的构建
• 2.10 酵母的转化与鉴定
• 2.10.1 酵母的转化
• 2.10.2 菌落PCR鉴定
• 第三部分 结果与分析
• +吸收动力学分析'>1 商陆K⁺吸收动力学分析
• +吸收动力学比较'>1.1 不同植物K⁺吸收动力学比较
• 1.2 不同供钾水平商陆根茎叶钾含量对比
• 2 商陆PaHAK1基因cDNA全长的克隆
• 2.1 商陆不同组织总RNA的提取
• 2.2 商陆3′非编码区cDNA的获得
• 2.3 商陆PaHAK1基因cDNA全长的PCR扩增、克隆及鉴定
• 3 商陆PaHAK1的生物信息学分析
• 4 商陆PaHAK1在不同组织中的表达分析
• 5 PaHAK1过表达载体的构建
• 5.1 过表达载体的构建
• 5.2 检测与鉴定
• 6 水稻的快速转化
• 6.1 农杆菌的转化
• 6.2 水稻的接种与浸染
• 6.3 抗性愈伤的筛选
• 6.4 抗性愈伤的分化
• 6.5 生根培养与炼苗
• 7 转基因水稻的检测
• 8 真核表达载体的构建
• 8.1 商陆PaHAK1的T-A克隆
• 8.2 真核表达载体的构建
• 9 酵母的转化
• 第四部分 讨论
• 1 商陆是一种钾高效吸收植物
• 2 PaHAK1在钾高亲和吸收方面发挥重要作用
• 3 在水稻中超表达PaHAK1基因
• 4 酵母突变体功能互补
• 全文总结及本研究的创新点
• 参考文献
• 附录: 缩略词
• 致谢
• 作者简介