靶向肿瘤的模拟逆转录病毒（mimoretrovirus）介导的针对人POKEMON基因的RNAi策略在宫颈癌基因治疗中的作用研究

论文摘要

宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一,由于肿瘤疾病的本质是“基因病”,宫颈癌也不例外,故从理论上讲,从基因水平来解决癌症问题是最佳途径。siRNA能够高效、特异地抑制靶基因的表达,已经成为应用于临床疾病尤其是肿瘤防治研究的有力工具。但是,对于RNAi应用到肿瘤的基因治疗而言,涉及到靶基因的选择和体内递送系统（宿主细胞的高效定向转运）等非常关键的问题。从目前国外文章报道情况来看,这些问题并没有很好地解决。所以,要解决用RNAi策略解决肿瘤的基因治疗问题,必须综合考虑这些问题才能真正使之将来应用于临床。在靶基因的选择问题上,由于肿瘤的发生涉及到体内诸多重要分子,而且这些分子在体内形成一个或多个复杂的网络。有些分子可能是位于这个网络的中下游,是具体执行细胞转化（transformation）或转化之后的某些功能的分子。如果对这些分子进行“基因沉默”,肿瘤细胞有可能通过其它支路或旁路进行信号转导而达到细胞转化的目的。基于此,虽然我们目前还不知道这个网络顶层的具体分子,但是如果我们对目前已知的位于最顶层的重要分子进行干预则应该会取得更好的效果。所以在我们的实验中选择了Pokemon原癌基因作为RNAi的靶标。Pokemon（for POK erythroid myeloid ontogenic factor）,发现于2005年,其在细胞分化中具有多种非常关键的功能,并且同其它POK家族成员如BCL6有物理性接触。已有的证据已经证明了其是肿瘤发生的一个关键因素。在人类多种肿瘤中该基因异常高表达。研究已经发现其作用模式为:Pokemon↑↑→ARF↓→MDM2→p53↓→肿瘤发生。所以,Pokemon的作用是位于许多肿瘤抑制基因和原癌基因的上游,故将其作为靶基因将有助于对肿瘤的根治。第二个关键问题是siRNAs的体内定向递送问题。这也是制约RNAi技术在体内应用的瓶颈之一。由于Pokemon蛋白的作用与细胞的分化、肿瘤的发生密切相关,所以在正常组织中不可避免地或多或少地存在,如果对机体所有组织细胞的Pokemon基因表达进行干扰可能会对正常组织分化、发育等生理过程带来负面影响。我们认为通过siRNAs向肿瘤组织特异靶向递送可以一方面避免这种负面影响,另一方面也可以有效地利用好有限的siRNAs资源,从而提高肿瘤基因治疗的效率。选择性地表达在肿瘤细胞及肿瘤组织新生血管上的整合素αvβ3的三肽Arg-Gly-Asp（RGD）能够把化学合成定向带到肿瘤组织部位,并取得较好的肿瘤治疗效果。但是化学合成siRNAs费用昂贵,并且还有作用时间不会太长（因为RNA在体内很容易被降解）和实际操作困难的问题（因为RNA水平的操作远较DNA水平操作麻烦）。并不适用于肿瘤防治这样一个长期的过程。逆转录病毒系统可以解决这个问题。逆转录病毒可以将其基因组插入到肿瘤细胞基因组中,并将从此长期存在,其效应也会与其相伴随。这也是逆转录病毒系统在RNAi领域和肿瘤治疗研究领域倍受关注的原因。但是,同其它病毒一样,逆转录病毒的制备过程仍很复杂,并且制备的逆转录病毒滴度仍是困扰实验进程的关键因素,并且它也没有组织靶向性。另外,由于病毒的成分复杂,其实际临床应用时将面临诸多疑问。基于此,我们将上述几种设想进行了整合,进行了以下实验:（一）针对Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒的构建及鉴定首先从Genebank中获取Pokemon原癌基因mRNA序列全长,通过Ambion公司在线设计工具,设计了4对针对Pokemon的siRNA序列,并将其分别定向克隆入pSilencer 5.1-H1 Retro逆转录病毒表达载体,并且将表达载体的线性载体的粘性末端用Klenow酶补平后,再连接起来构建了空载体对照质粒,经过双酶切、及测序鉴定,确定了所构建的重组Pokemon siRNAs表达质粒及空载体对照质粒是完全成功的。（二）各重组逆转录病毒质粒对Pokemon基因沉默效应的检测及其对Hela细胞生物学性状的改变然后,将所构建的重组质粒直接转染Hela细胞,经过嘌呤霉素筛选,获得稳定转染4个编码不同siRNA序列重组质粒及空载体对照质粒的Hela细胞。经过Q-PCR以及WB检测,观察了转染不同siRNA表达质粒后,Hela细胞中Pokemon基因的表达情况。并且应用MTT、凋亡关键酶Capase3/7活性检测、以及transwell侵袭性检测等方法,检测了稳定转染重组质粒后,Hela细胞生物学性状的改变,进一步验证了Q-PCR及WB的结果,筛选出沉默效应最好的siRNA序列。Q-PCR及WB结果显示:与未转染组Hela细胞相比,转染编码GTCCTCGTCCTTAAAGTGC的HpsiRNA-4的Hela细胞中, Pokemon基因表达下降了83%,同时对其增殖速率、以及侵袭性等生物学性状的观察也发现,其增殖速度为未转染Hela细胞的65%,侵袭性减弱为30%,其凋亡关键酶活性则上升为未转染组的2.2倍。从上述结论看来,通过对Hela细胞中Pokemon基因的沉默,可以促使Hela细胞的表型呈良性转变,为后期的在体肿瘤预防性实验和治疗性实验提供了实验基础。（三）针对POKEMON基因的siRNA逆转录病毒及其模拟逆转录病毒的制备为了尝试解决siRNAs体内定向递送的问题,我们利用本教研室已经研制的富含正电荷的mimovirus多聚赖氨酸系统,它可以通过电荷间的相互作用与带负电荷的DNA自组装形成纳米级病毒样颗粒。并将靶向肿瘤及肿瘤新生血管的三肽Arg-Gly-Asp（RGD）整合其中,设计了momiretrovirus的多肽包装系统,在RGD肽与多聚赖氨酸的连接方式上采用了直接连接和柔性Linker连接两种方式,其序列为KKKKKKKKKKKKKKKKKK - ACRGDMFGCA（直接连接）和KKKKKKKKKKKKKKKKKK{acp}S {acp}S{acp}SACRGDMFGCA（柔性Linker连接）,上述多肽包装系统在HBS缓冲液中与重组质粒可以自组装形成了20nm大小的病毒样颗粒,我们通过了不同电荷比情况下,靶向肿瘤的多聚赖氨酸系统对重组siRNA表达质粒的包被情况以及所形成的病毒样颗粒的大小。并且通过DNaseⅠ保护实验检测了我们所设计的靶向肿瘤的多聚赖氨酸系统对核酸酶的抵抗作用。在体外实验中,初步证实了这一系统可以通过系统给药来完成对siRNA表达质粒的递送。为了观察我们所设计的模拟逆转录病毒对Pokemon基因的沉默作用,我们用不同的电荷比所制备的模拟逆转录病毒包括2种靶向肿瘤的模拟病毒（K18+RGD,K18+Linker+RGD）以及单纯多聚赖氨酸（K18）所制备的非靶向的模拟逆转录病毒,在体外分别感染Hela细胞,并通过Q-PCR检测了Hela细胞被感染后,其Pokemon基因的表达水平。作为对照,我们还观察了用滴度为105CFU/ml感染的Hela细胞以及把200ngsiRNA表达质粒用转染试剂直接转染Hela细胞后,Pokemon基因的表达变化。凝胶阻滞实验以及结果显示,当电荷比达到2以上时,质粒所带的负电荷被完全中和,同时透射电镜观察也显示只有当电荷比达到2以上时,多肽包装系统才能与质粒自组装形成完整的病毒样颗粒。DNaseⅠ保护性实验也证实了,只有在此电荷比以上时,多肽包装系统才能对质粒起到完全的保护作用。Q-PCR检测结果显示, K18+RGD,K18+Linker+RGD及K18对照组模拟逆转录病毒的沉默效应无显著差异,均在电荷比为4时的沉默效应最强,在此比例下感染Hela细胞,其Pokemon基因的表达均相当与正常Hela细胞下降了43%,而逆转录病毒感染组下降了约50%左右。（四）模拟逆转录病毒抗肿瘤效应的在体研究最后,为观察靶向肿瘤的模拟逆转录病毒在活体内的作用,我们在SCID小鼠的腹股沟区皮下接种1×107个Hela细胞建立了移殖瘤模型,进行了预防性实验和治疗性实验。在预防性实验中,我们在接种Hela细胞的同时,就通过小鼠尾静脉注射了相当于4pmol重组siRNA表达质粒的模拟逆转录病毒,此后每5天注射一次,并观察我们所制备的模拟逆转录病毒预防肿瘤生成的作用。在治疗性实验中,则将首次注射时间改在接种后12d,肿瘤直径为5mm左右时。预防性实验结果显示,接种Hela细胞3周后,注射靶向肿瘤的2种模拟病毒的10只小鼠均无肿瘤生成,在K18对照组也仅有2只小鼠生成肿瘤,而空白对照组及空载对照组的各5只小鼠均在12d左右就有可触及的肿瘤生成。在治疗性实验中,经过4次注射后,在K18+RGD,K18+Linker+RGD实验组以及K18对照组中,肿瘤生长均明显受到抑制,肿瘤体积明显小于空白对照及空载对照组。在这些实验组中,K18+Linker+RGD组的效果最好。综上所述,本研究构建了针对Pokemon癌基因的重组逆转录病毒siRNA表达质粒,并且证实了通过下调Pokemon基因的在肿瘤细胞内的表达,可以促进其生物学表型发生良性转变;在此基础上,设计制备了模拟逆转录病毒,并且在活体内初步观测了模拟逆转录病毒的抗肿瘤效应,上述结果证实了Pokemon原癌基因可以作为有效的RNAi靶基因,而且我们所设计的模拟逆转录病毒系统是一种新的、有效的肿瘤基因治疗策略,为肿瘤基因治疗提供了新的线索和思路。

论文目录

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• 论文正文 靶向肿瘤的模拟逆转录病毒（mimoretrovirus）介导的针对人 POKEMON基因的RNAi 策略在宫颈癌基因治疗中的作用研究
• 前言
• 第一章 针对Pokemon 基因的siRNA 逆转录病毒重组表达质粒的构建及鉴定
• 实验材料及仪器
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二章 各重组逆转录病毒质粒对Pokemon 基因沉默效应的检测及其对Hela 细胞生物学性状的改变
• 第一节 Hela 细胞中Pokemon 基因表达的验证
• 主要实验试剂和材料与方法
• 实验结果
• 第二节 HpsiRNA 体外基因沉默筛选实验
• 实验材料与方法
• 实验结果
• 第三节 沉默Pokemon 基因对Hela 细胞生物学性状的改变
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三章 针对POKEMON 基因的siRNA 逆转录病毒及其模拟逆转录病毒的制备
• 第一节 逆转录病毒的制备及沉默效应检测
• 主要实验试剂和材料与方法
• 实验结果
• 第二节 模拟逆转录病毒的制备及其在体外培养细胞中的沉默效应检测
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 第四章 模拟逆转录病毒抗肿瘤效应的在体研究
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 核酸的生物性靶向递送策略与肿瘤基因治疗
• 参考文献
• 文献综述 RNA 干扰在肿瘤研究中的进展
• 参考文献
• 硕士期间发表的文章