葡萄糖转运载体GLUT1、GLUT2和GLUT3在粟酒裂殖酵母中的表达及GLUT家族进化分析

论文摘要

膜蛋白是生物膜功能的主要体现者,涉及到许多重要的生物学过程,编码膜蛋白的基因约占总的蛋白编码基因的30%,深入研究膜蛋白对于阐明生命活动的基础与规律极其重要。但是,绝大多数的天然膜蛋白在细胞膜中含量很低,分离纯化极其困难,严重制约对膜蛋白结构和功能的研究,以膜蛋白为靶标的创新药物的研发,以及膜蛋白抗体的生产。因此,体外重组表达成为研究膜蛋白的重要方法和手段,但它同样也存在许多困难,尤其是表达膜内在蛋白（integral membrane proteins, IMPs）。异源或同源表达跨膜蛋白常常表现为表达量低,没有功能活性,或形成不可溶的包涵体,或对宿主产生毒性。另外,表达的膜蛋白能否正确的插入宿主细胞膜也难以预测和控制。因此,许多学者都致力于膜蛋白的体外高效表达,纯化和结晶的探索和开发,以促进膜蛋白结构和功能的研究。葡萄糖是细胞主要的代谢底物和能源物质。易化葡萄糖转运载体（Facilitates glucose transporters, GLUTs）摄取和转运葡萄糖,是关键的细胞代谢调节器之一。因此,研究GLUTs的结构和功能,能更深入了解它们在细胞糖代谢过程中的重要作用和机理,但这依赖于大量纯化的、有功能活性的GLUT蛋白。由于真核膜蛋白,尤其是多次跨膜蛋白难于表达和纯化,目前为止,还没有体外高效表达GLUTs的报道。本实验利用分子生物学技术,获得了人类GLUT家族GLUT1、GLUT2和GLUT3三个家族成员的全长基因,构建了pESP-GLUTs表达载体,实现了GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3融合蛋白在粟酒裂殖酵母中的高效表达。表达载体pESP-2上的启动子nmt1受硫胺素浓度的严格调控;融合蛋白通过GST亲和层析一步纯化得到。1升酵母培养液收集到湿重约3克的酵母菌,纯化可得到最多约300微克的融合蛋白。GLUT1、GLUT2和GLUT3均含有十二个跨膜结构域,这提示真核跨膜蛋白能够有效的在粟酒裂殖酵母中表达和纯化。同时,本实验还以GLUT1为例,分析了不同培养条件下,不同酵母生长状态下表达蛋白的RNA表达水平,蛋白产量以及宿主相关基因的表达情况。实验结果显示:1.通常选择的粟酒裂殖酵母最佳的生长条件（28-30oC, pH 5.5）并不是膜结合膜蛋白（即结合在宿主细胞膜上的那部分膜蛋白）表达的最佳条件;2.所得到的总的膜蛋白表达量并不能作为膜结合的膜蛋白表达量的指示,它们之间没有必然联系;3.在同一培养条件,不同酵母生长状态下,膜蛋白的RNA表达水平与膜蛋白表达量无明显关系;4.不同培养条件下,膜结合膜蛋白表达差异与一部分涉及膜蛋白分泌途径的宿主基因差异表达相关。另外,本实验采用GST-pulldown技术,验证GLUT1与3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的相互作用。SDS-PAGE和WB结果均提示表达的GLUT1能与GAPDH在体外相互作用,说明在裂殖酵母中异源表达的GLUT1具有部分生物学活性。获得高效的膜蛋白的抗体一直是一个难题。目前大部分的膜蛋白抗体都是利用多肽片段免疫动物得到,并不适用于所有的实验研究。本实验利用纯化的GLUT1蛋白免疫Balb/c小鼠生产了多克隆抗体。经SDS-PAGE和WB实验证明该抗体为匀质的、特异性高的抗GLUT1小鼠多抗。我们相信这个抗体将在后续的对GLUT1的研究中发挥重要的作用。最后我们对GLUT蛋白家族进行了进化分析。我们通过从多种原生动物,真菌,无脊椎动物和脊椎动物中基因组中分离出GLUT家族成员,构建了它们的进化树,分析了GLUT家族的进化历史。结果表明GLUT家族的最重大的分化发生在无脊椎动物和脊椎动物分化之后,鱼类和陆生脊椎动物分化之前。非同义突变率与同义突变率的比值（Ka /Ks）表明哺乳动物的GLUT非常的相似,功能区非常保守,但鱼类和哺乳类GLUT差异较大,从另一方面佐证了GLUT在鱼类和陆生脊椎动物类的发生了较大的分化。另外我们还单独分析了GLUT1的进化树,通过生物信息学工具对GLUT1在三维结构上的保守区进行了分析,结果表明GLUT1的保守区和非保守区在每个跨膜区中是交替出现的。GLUT1家族在其蛋白质序列上有58个最保守的氨基酸位点,其中包含了一些实验已经验证的GLUT1的重要功能位点。在GLUT1中,除已经验证QLS和QLG这两个重要的模序外,我们还发现了另外新的一个非常保守的模序（NAP）,该模序的功能可能和QLS类似,是GLUT1转运葡萄糖所必须的。

论文目录

• 中文部分
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1 文献综述
• 1.1 真核膜蛋白表达现状综述
• 1.1.1 表达体系
• 1.1.2 表达条件
• 1.1.3 蛋白纯化策略
• 1.1.4 真核内在膜蛋白重组的综合考虑
• 1.2 ESP–S. pombe 粟酒裂殖酵母表达系统简介
• 2 基因克隆和载体构建
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 主要仪器和设备
• 2.3 方法
• 2.3.1 GLUT1、 GLUT2 和GLUT3 全长基因的克隆
• 2.3.2 pESP-GLUTs 表达载体的构建
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 GLUT1、 GLUT2 和 GLUT3 全长基因的克隆
• 2.4.2 pESP-GLUTs 表达载体的构建及DNA 测序
• 3 葡萄糖转运载体 GLUT1、GLUT2 和GLUT3 在S.pombe 中的表达及宿主相关基因表达情况的实验研究
• 3.1 材料和试剂
• 3.2 主要仪器和设备
• 3.3 方法
• 3.3.1 粟酒裂殖酵母的转化
• 3.3.2 融合蛋白诱导表达条件的优化（以GST-GLUT1 为例）
• 3.3.3 GLUT1 表达的半定量RT-PCR 分析
• 3.3.4 不同诱导条件下宿主相关基因表达的半定量分析
• 3.3.5 融合蛋白GST-GLUT1 的亲和层析纯化
• 3.3.6 融合蛋白GST-GLUT2、GST-GLUT3 的表达纯化
• 3.3.7 蛋白免疫印迹分析
• 3.3.8 纯化蛋白的定量
• 3.4 结果
• 3.4.1 酵母转化鉴定
• 3.4.2 融合蛋白诱导表达条件的优化（以GST-GLUT1 为例）
• 3.4.3 GLUT1 表达的半定量RT-PCR 分析
• 3.4.4 不同诱导条件下宿主相关基因表达的半定量分析
• 3.4.5 融合蛋白GST-GLUT1 的亲和层析纯化
• 3.4.6 融合蛋白GST-GLUT2、GST-GLUT3 的表达纯化
• 3.4.7 蛋白免疫印迹分析
• 3.4.8 纯化的融合蛋白定量
• 3.5 讨论
• 4 GLUT1 与GAPDH 体外相互作用的鉴定
• 4.1 材料和试剂
• 4.2 主要仪器和设备
• 4.3 方法
• 4.4 结果
• 4.4.1 GLUT1 和GAPDH 的相互作用的SDS-PAGE 分析
• 4.4.2 GLUT1 和GAPDH 的相互作用的Western-blotting 分析
• 4.5 讨论
• 5 GLUT1 小鼠多克隆抗体的生产
• 5.1 材料和试剂
• 5.2 主要仪器和设备
• 5.3 方法
• 5.3.1 融合蛋白的酶切
• 5.3.2 小鼠免疫
• 5.3.3 ELISA 法检测抗血清效价
• 5.3.4 蛋白A/G 柱纯化抗血清
• 5.3.5 纯化抗体的SDS-PAGE 和Western-blotting 分析
• 5.4 结果
• 5.4.1 融合蛋白的酶切
• 5.4.2 ELISA 法检测抗血清效价
• 5.4.3 纯化抗体的SDS-PAGE 分析
• 5.4.4 纯化抗体的 Western-Blotting 分析
• 5.5 讨论
• 6 葡萄糖转运蛋白（GLUT）家族的进化分析及GLUT1 结构信息分析
• 6.1 绪论
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 数据收集
• 6.2.2 多重序列比对，进化树构建和Ka/Ks 分析
• 6.2.3 GLUT1 蛋白结构保守性的分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 GLUT 家族成员在物种中的分布
• 6.3.2 GLUT 家族系统发育分析
• 6.3.3 Ka/Ks 分析
• 6.3.4 GLUT1 （SLC2A1）进化分析
• 6.3.5 GLUT1 结构上的保守序列分析
• 6.4 讨论
• 7 主要的实验结果和结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A 各种溶液、缓冲液及培养基配方
• B 在读期间已发表及待发表的文章
• C 在读期间负责和参研的课题
• 英文部分
• 摘要
• ABSTRACT
• ABBREVIATIONS
• 中文概要
• CHAPTER ONE INTRODUCTION
• 1.1 Overview of Eukaryotic Membrane Protein Expression
• 1.1.1 Expression systems
• 1.1.2 Expression conditions
• 1.1.3 Protein purification strategies
• 1.1.4 Integrated considerations recombination of eukaryotic IMPs
• 1.2 Introduction of pESP2–S. pombe expression system
• CHAPTER TWO GENE CLONING AND VECTOR CONSTRUCTION
• 2.1 Materials and Reagents
• 2.2 Equipments
• 2.3 Methods
• 2.3.1 Cloning the full length gene fragments of GLUT1, GLUT2 and GLUT3
• 2.3.2 Construction of pESP-GLUT plasmids
• 2.4 Results and Discussion
• 2.4.1 Cloning the full length gene fragments of GLUT1, GLUT2 and GLUT3
• 2.4.2 Construction of pESP-GLUT plasmids and DNA sequencing
• CHAPTER THREE THE HETEROLOGOUS EXPRESSION AND PURIFICATION OF HUMAN GLUT1, GLUT2 AND GLUT3 IN S. pombe AND THE RELATED ENCODING GENES EXPRESSION OF THE HOST
• 3.1 Materials and Reagents
• 3.2 Equipments
• 3.3 Methods
• 3.3.1 Fission yeast （SP-Q01） transformation
• 3.3.2 Optimization of fusion protein expression （take GST-GLUT1 as the example）
• 3.3.3 Semi-quantitative RT-PCR analysis of GLUT1 expression
• 3.3.4 The related encodeing genes expression of the host under different growth conditions
• 3.3.5 GST-affinity chromatography purification of GST-GLUT1
• 3.3.6 Expression and purification of GST-GLUT2, GST-GLUT3
• 3.3.7 Western-blotting analysis
• 3.3.8 Calculation of protein concentrations and yields
• 3.4 Results
• 3.4.1 Verification of Fission yeast transformation
• 3.4.2 Optimization of fusion protein expression （take GST-GLUT1 as the example）
• 3.4.3 Semi-quantitative RT-PCR analysis of GLUT1 expression
• 3.4.4 The related encoding genes expression of the host under different growth conditions
• 3.4.5 GST-affinity chromatography purification of GST-GLUT1
• 3.4.6 Expression and purification of GST-GLUT2, GST-GLUT3
• 3.4.7 Western-blotting analysis of GST-GLUTs
• 3.4.8 Calculation of protein concentrations and yields
• 3.5 Discussion
• CHAPTER FOUR VERIFICATION OF THE INTERACTIONS BETWEEN GLUT1 AND GAPDH
• 4.1 Materials and Reagents
• 4.2 Equipments
• 4.3 Methods
• 4.4 Results
• 4.4.1 Detection of the interactions between GLUT1 and GAPDH by SDS-PAGE
• 4.4.2 Western-blotting analysis
• 4.5 Discussion
• CHAPTER FIVE MOUSE POLYCLONAL ANTIBODY PRODUCTION OF GLUT1
• 5.1 Materials and Reagents
• 5.2 Methods
• 5.2.1 Protein preparation
• 5.2.2 Mice immunization
• 5.2.3 Screening of Polyclonal Antibody using ELISA Assay
• 5.2.4 Purification of the antiserum using Protein A/G column
• 5.2.5 SDS-PAGE and Western-blotting analysis
• 5.3 Results and Discussion
• 5.3.1 Protein digestion
• 5.3.2 Titre of Polyclonal Antibody using ELISA Assay
• 5.3.3 The purified polyclonal antibody analysis by SDS-PAGE
• 5.3.4 Western-blotting analysis
• CHAPTER SIX EVOLUTION OF GLUT FAMILY AND A COMPARATIVE STRUCTURAL BIOINFORMATICS ANALYSIS OF GLUT1
• 6.1 Introduction
• 6.2 Materials and methods
• 6.2.1 Data sets
• 6.2.2 Multiple sequence alignment, phylogenetic tree reconstruction and Ka/Ks analysis
• 6.2.3 Calculation of Consurf Conservation Scores
• 6.3 Results
• 6.3.1 GLUT gene repertoires in animals
• 6.3.2 Phylogenetic analysis of GLUT family
• 6.3.3 Ka/Ks analysis
• 6.3.4 Evolution analysis of GLUT1 （SLC2A1）
• 6.3.5 GLUT1 conservation
• 6.4 Discussion
• 6.4.1 Large Variation of GLUT Gene Repertoire in Vertebrate Species
• 6.4.2 Evolution of Vertebrate GLUT Genes
• 6.4.3 GLUT1 conservation in structure
• CONCLUSIONS
• ACKNOWLEDGEMENTS
• REFERENCES
• APPENDIX
• A Buffers and solutions
• B 在读期间已发表及待发表的文章
• C 在读期间负责和参研的课题