维吾尔族妇女子宫颈癌微小RNA差异表达及其与靶基因关系的研究

维吾尔族妇女子宫颈癌微小RNA差异表达及其与靶基因关系的研究

论文摘要

目的:子宫颈癌的早期诊断对子宫颈癌的治疗至关重要。本研究通过筛选维吾尔族妇女子宫颈癌微小RNA(microRNA, miRNAs,miRNA)差异表达谱,并检测差异表达最明显的miRNA在维吾尔族妇女子宫颈癌中的表达;预测该miRNA的靶基因,检测靶基因蛋白在子宫颈癌中的表达及临床意义,探讨miRNAs与靶基因的关系。为子宫颈癌分子机理研究提供新的思路和途径,为子宫颈癌早期诊断分子指标的筛选奠定基础。方法:1)选取3例子宫颈癌(实验组)和3例慢性宫颈炎组织(对照组),Trizol一步法提取组织中总RNA,鉴定总RNA的质量。使用晶芯miRNA荧光标记试剂盒与杂交试剂盒,样品经Cy3荧光标记后与含有576条人类miRNAs探针的哺乳动物miRNAs微阵列芯片V4.0进行杂交。杂交后洗涤过的芯片进行扫描和图像分析,用SAM version 3.02软件筛选差异表达基因,筛选条件为:FDR控制在5%以内,Fold change≥2或≤0.5。选择筛选出的2个差异表达明显的miRNAs进行实时荧光定量PCR (Real-time PCR)验证;2)采用Real-time PCR检测miR-101在子宫颈癌和慢性宫颈炎组织中的表达水平;3)采用锁定核苷酸原位杂交(LNA-ISH)技术检测miR-101在子宫颈癌和慢性宫颈炎组织中的定位表达情况;4)选用互联网上miRNAs靶基因预测软件(Targetscan Pictar、MiRanda),并结合文献报道筛选与miR-101关系最密切的靶基因;5)采用Western blot免疫印记法检测miR-101靶基因EZH2蛋白在子宫颈癌和慢性宫颈炎组织中的表达;6)采用免疫组织化学法检测EZH2蛋白在子宫颈癌和慢性宫颈炎组织中的表达,并分析其与临床病理参数之间的关系。结果:1) miRNAs在维吾尔族妇女子宫颈癌中的差异表达:实验组和对照组差异表达的miRNAs共有12个,在子宫颈癌中均为表达下调,分别为hsa-miR-101, hsa-miR-572, hsa-miR-424, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-365, hsa-miR-675, hsa-miR-187, hsa-miR-1247, hsa-miR-634, hsa-miR-1224-3p, hsa-miR-1238, hsa-miR-125a-5p。Real-time PCR验证结果:hsa-miR-101在实验组和对照组中的平均表达丰度分别为0.91±0.22和2.96±1.24,差异具有统计学意义(P<0.05)。hsa-miR-125a-5p在实验组和对照组中的平均表达丰度分别为11.51±3.33和39.95±11.08,差异具有统计学意义(P<0.05),hsa-miR-101和hsa-miR-125a-5p在子宫颈癌中表达下调,与芯片结果一致;2)miR-101在维吾尔族妇女子宫颈癌组织中的表达:Real-time PCR结果:miR-101在实验组和对照组中的表达丰度平均值为1.41±0.84和19±0.94,差异具有统计学意义(P<0.05)。LNA-ISH结果:对照组miR-101阳性表达率为72%(18/25),表现为子宫颈鳞状上皮细胞的胞浆呈现团块状紫蓝色着色;实验组miR-101阳性表达率为8%(2/25),差异具有统计学意义(P<0.05)。3.miR-101靶基因蛋白在维吾尔族妇女子宫颈癌中的表达和临床意义及miR-101与其靶基因的关系:在3个预测软件中同时出现的miR-101的靶基因有103个,结合国外文献报道,筛选出与miR-101关系最密切的靶基因为EZH2。Western blot结果:EZH2蛋白表达浓度在子宫颈癌中为1.17±0.06,对照组为0.99±0.06,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果:EZH2蛋白产物阳性信号定位于细胞核,呈浅黄、棕黄或棕褐色着色。子宫颈癌组阳性表达率为61%(36/59),对照组阳性表达率为28.9%(13/45),差异具有统计学意义(P<0.05)。EZH2蛋白表达在子宫颈癌的不同年龄、不同病理分级和不同临床分期间差异无统计学意义(P>0.05)。miR-101表达丰度和EZH2蛋白浓度之间相关性分析R=-0.394,差异无统计学意义(P>0.05)。miR-101 LNA-ISH结果和EZH2免疫组化结果相关性分析:R=-0.441,二者呈负相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1)本研究在维吾尔族妇女子宫颈癌中首次发现了12种差异表达的miRNAs,在子宫颈癌中全部为表达下调,证实了微小RNA参与了维吾尔族妇女子宫颈癌的发生和发展;2)hsa-miR-572、hsa-miR-1247、hsa-miR-1224-3p、hsa-miR-1238在国内外文献中未见报道;而hsa-miR-101、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-365、hsa-miR-675、hsa-miR-187、hsa-miR-634与其他一些肿瘤的发生与发展有关,但未见在子宫颈癌中的报道;3)在12种差异表达的miRNAs中,miR-101在维吾尔族妇女子宫颈癌中呈明显的低表达,是一种功能上类似抑癌基因的miRNAs。4)采用生物信息学技术预测并结合国外文献,发现与miR-101关系最紧密的靶基因为EZH2,EZH2在蛋白水平的表达在子宫颈癌明显增高,但在子宫颈癌患者的不同年龄、不同病理分级、不同临床分期之间的差异均无统计学意义。miR-101与EZH2的表达具有负性相关的趋势,EZH2是miR-101调节的靶基因之一。5)miR-101在维吾尔族妇女子宫颈癌中表达下调,它调控的靶基因EZH2蛋白表达水平增高,可能是维吾尔族妇女子宫颈癌的发生机制之一。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 第一部分 维吾尔族妇女子宫颈癌相关miRNA表达谱研究
  • 引言
  • 1. 研究内容和方法
  • 1.1 研究对象
  • 1.2 试剂与材料
  • 1.3 方法
  • 1.4 统计分析
  • 2. 结果
  • 3. 讨论
  • 4. 小结
  • 第二部分 miR-101在维吾尔族妇女子宫颈癌中的差异表达研究
  • 引言
  • 1. 研究内容与方法
  • 1.1 研究对象
  • 1.2 内容与方法
  • 1.3 统计方法
  • 2. 结果
  • 3. 讨论
  • 4. 小结
  • 第三部分 miR-101靶基因EZH2在维吾尔族妇女子宫颈癌中的表达和临床意义及其与miR-101的关系
  • 引言
  • 1. 研究内容与方法
  • 1.1 研究对象
  • 1.2 内容与方法
  • 1.3 统计方法
  • 2. 结果
  • 3. 讨论
  • 4. 小结
  • 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 综述
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间发表的论文
  • 个人简历
  • 导师评阅表
  • 相关论文文献

    标签:;  ;  ;  ;  ;  

    维吾尔族妇女子宫颈癌微小RNA差异表达及其与靶基因关系的研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢