IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用

论文摘要

鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease, IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病不仅引起患病动物死亡,而且还导致机体免疫抑制,使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败。对易感鸡群实施疫苗接种是预防该病最有效的方法,但由于各地流行的IBDV毒株的毒力与抗原性的差异,给疫苗毒株的选择造成较大的困难,每年因IBD发病死亡、免疫抑制、免疫失败造成的经济损失巨大。目前广泛应用中等毒力的IBD活疫苗,给IBD的防控带来极大的隐患,灭活疫苗存在着抗原制备的困难。因此,进一步研制新型基因工程疫苗,仍是当前禽病防控工作中亟待解决的重要课题。试验1：IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达运用PCR重叠延伸技术将传染性法氏囊病病毒（IBDV）多表位5e与vp2基因连接构建组合基因vp2-5e,将其插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHT中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBacHT-vp2-5e,用脂质体法转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒vBacHT-vp2-5e。对vBacHT-vp2-5e感染的Sf9细胞,以间接免疫荧光试验（IFA）检测,具有特异性荧光；电镜检查,重组VP2-5E蛋白能够自组装成病毒样颗粒（VLP）；用免疫印迹分析（Western-blotting）,在59kD处出现一条特异性蛋白条带。试验2：IBDV模拟表位与vp2组合基因重组蛋白的应用用IBDV模拟表位与vp2组合基因重组蛋白免疫SPF鸡,第一次免疫14d后,组合基因重组蛋白组的ELISA抗体效价为1746,攻毒死亡率为40%,而用单一VP2重组蛋白组的ELISA抗体效价为1359,攻毒死亡率为50%；第二次免疫14 d后,组合基因重组蛋白组ELISA抗体效价上升到4598,攻毒死亡率为0%,单一VP2重组蛋白组抗体效价为4044,攻毒死亡率为10%。实验结果表明,组合基因重组蛋白免疫鸡可以抵抗IBDV强毒攻击且优于单一VP2重组蛋白。以组合基因重组蛋白VP2-5E作为包被抗原,建立了IBDV抗体ELISA检测方法,重组抗原包被浓度为5μg/mL,被检血清样品1：400稀释。特异性试验表明,与新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、减蛋综合征病毒（EDSV）、禽流感病毒H9N2亚型的阳性血清均无交叉反应；重复性试验结果表明,间接ELISA方法批内、批间变异系数小于10%。将本实验建立的方法与IDEXX公司ELISA检测试剂盒进行了比较,检测200份IBDV血清样品,阳性符合率为92.9%,阴性符合率100%。实验结果表明,本实验建立的IBDV抗体ELISA检测方法具有良好的特异性与重复性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一篇 文献综述
• 1 IBDV概述
• 2 IBDV病原学特性
• 2.1 IBDV结构特性
• 2.2 理化特性
• 2.3 生物学特性
• 3 IBDV基因组结构及蛋白功能
• 3.1 IBDV基因组结构
• 3.2 病毒蛋白及其功能
• 3.2.1 VP1蛋白
• 3.2.2 VP2蛋白
• 3.2.3 VP3蛋白
• 3.2.4 VP4蛋白
• 3.2.5 VP5蛋白
• 4 IBD的防控
• 4.1 IBD的检测
• 4.2 IBD的预防
• 4.2.1 常规疫苗
• 4.2.2 基因工程疫苗
• 4.2.3 表位疫苗
• 参考文献
• 第二篇 研究内容
• 第一章 IBDV模拟表位与VP2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒、菌种和细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 组合基因的分子设计与克隆
• 1.4 组合基因重组供体质粒的构建
• 1.5 组合基因重组杆状病毒表达质粒的构建
• 1.6 组合基因重组杆状病毒的获得
• 1.7 组合基因重组杆状病毒的鉴定
• 1.7.1 IFA检测
• 1.7.2 电镜检查
• 1.7.3 免疫印迹分析（Western blotting）
• 2 结果
• 2.1 组合基因的分子设计与克隆
• 2.2 组合基因重组供体质粒的构建
• 2.3 组合基因重组杆状病毒表达质粒的构建
• 2.4 组合基因重组杆状病毒的获得
• 2.5 组合基因重组杆状病毒的鉴定
• 2.5.1 IFA
• 2.5.2 电镜检查
• 2.5.3 免疫印迹分析（Western blotting）
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 IBDV模拟表位与VP2组合基因重组蛋白的应用
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒与试剂
• 1.2 重组杆状病毒的鉴定
• 1.2.1 免疫印迹分析（Western blotting）
• 1.2.2 电镜检查
• 1.3 组合基因重组蛋白的动物免疫保护试验
• 1.3.1 试验动物
• 1.3.2 动物分组与免疫
• 1.3.3 攻毒试验
• 1.4 间接ELISA方法的建立
• 1.4.1 抗原的制备
• 1.4.2 抗原包被浓度与血清稀释度的确定
• 1.4.3 封闭液的确定
• 1.5 间接ELISA试验步骤
• 1.6 间接ELISA临界值的确定
• 1.7 特异性试验
• 1.8 重复性试验
• 1.9 与IDEXX试剂盒的比较试验
• 2 结果
• 2.1 重组杆状病毒的鉴定
• 2.1.1 免疫印迹分析（Western blotting）
• 2.1.2 电镜检查
• 2.2 组合基因重组蛋白免疫攻毒试验
• 2.3 间接ELISA方法的建立
• 2.3.1 包被抗原的制备
• 2.3.2 抗原包被浓度与血清稀释度的确定
• 2.3.3 封闭液的确定
• 2.4 间接ELISA临界值的确定
• 2.5 间接ELISA的特异性
• 2.6 间接ELISA的重复性
• 2.7 与IDEXX试剂盒的比较试验
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录