一个罕见多癌家系易感基因的定位与突变筛查的初步研究

论文摘要

癌家族（cancer family）与家族癌（familial aggregated cancerpedigree）不同,其特征表现为不同种类的癌肿在家族中聚集发生。其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变,参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异,对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。尽管一些实验室对多癌家系的病例也有报道,但家系中的癌症患者大多已经死亡,不能为研究提供足够的遗传信息,其真正的分子遗传机制仍不明了。缺少具有研究价值的家系样本以及缺乏对肿瘤抑瘤＼易感基因群精细定位的高效率研究手段,一直是阻碍多癌家系（multi-cancer pedigree）发病机制研究的瓶颈。【一个罕见大多癌家系的抢救性保护与采集】我们在湖南长沙意外的发现了一个罕见大多癌家系,包括6代超过103个成员。家系中有患者15人,其中现症者（affected survivals）10人,涉及包括子宫内膜癌（endometrial cancer）、子宫肌瘤（hysteromyoma）、乳腺癌（breast carcinoma）、乳腺纤维瘤（breastfibroids）、结肠癌（colon carcinoma）、直肠癌（rectal cancer）、胃癌（gastric cancer）、血管瘤（hemangioma）、肾囊肿（cyst of kidney）等在内的多种肿瘤。某些患者在他的一生当中多次罹患几种不同的肿瘤,如Ⅱ-1先后患有子宫肌瘤和乳腺癌、Ⅳ-1先后患有血管瘤和子宫肌瘤、Ⅳ-3先后患有结肠癌、直肠癌和乳腺纤维瘤、Ⅳ-4患有结肠癌和子宫内膜癌。其中以乳腺、生殖系统和消化系统的肿瘤占多数,分别占到总人次的50%和37.5%。10名患者在家系中表现连续两代分布,其中男性患者2人,女性患者8人,存在一定的性别差异,但主要还是表现为常染色体显性遗传。家系平均发病年龄为42.5岁,Ⅴ-30发病年龄最早为29岁,Ⅱ-1发病年龄最晚为61岁,发病年龄有逐代提前趋势,呈遗传早现（anticipation）现象。该多癌家系具有人数多、现症者多、癌症种类繁多的特点,属于非常罕有、珍贵的遗传资源。其中有的患者已经进入癌症晚期,生命危在旦夕,为了保全最完整的家系样本和遗传信息,我们正争分夺秒尽全力予以抢救,采集每个样本时同步进行了外周血永生化淋巴细胞建系（peripheral blood lymphocytes immortalization）。目前,我们已采集了24个核心成员的外周血样本,其中患者8人,非受累个体10人,外系6人,其平均年龄为44.91±16.80岁（8-73岁）。其中有21例核心家系成员样本成功完成了外周血永生化淋巴细胞建系,包括患者7人,非受累个体8人,外系6人,为反复深入多癌家系发病机制研究做好充分准备。完成对该罕见大多癌家系的妥善保护与采集无疑为癌家族复杂的病因学机制研究提供了宝贵、翔实的研究材料,深入其分子遗传学研究对填补国际领域多癌家系研究方向的空白具有重要的战略意义和现实意义。【本文研究思路】目前,针对疾病基因的定位克隆（positional cloning）策略是疾病家系易感基因研究的有效手段。因此,本文拟通过基于家系的连锁分析策略,首先,采用高通量SNP芯片对24例多癌家系核心成员进行全基因组扫描、基因分型（genotyping）和连锁分析（linkageanalysis）,定位该罕见多癌家系的遗传易感区段,在此基础上,进一步采用微卫星（Microsatellite,MS）精细扫描定位（fine mapping）、连锁分析和单体型分析（haplotype analysis）,验证连锁;然后,通过基于直接测序的易感基因突变筛查策略,对前期定位的遗传易感区段中的候选肿瘤易感基因进行突变筛查,同时针对全基因组范围的一些具有重要功能的癌基因（Oncogene）、抑癌基因（Tumor suppressorgene）,以及与李凡氏综合症、家族性结直肠癌（familial colorectalcancer）和家族性乳腺癌疾病关系密切的基因展开突变筛查（mutationscreen）,以期找到与多癌家系发病密切相关的基因改变。【基于SNP芯片的全基因组连锁分析】首先采用Affymetrix公司包含50万个单核苷酸多态（Singlenucleotide polymorphism,SNP）位点的GeneChip? Mapping 500K array对多癌家系中的24个核心家系成员进行全基因组扫描（genome-widescan）和基因分型（genotyping）。根据Affymetrix公司提供的Gtype软件进行SNP基因分型,MERLIN软件用来进行两点连锁分析（Two-point linkage analysis）。参数连锁分析中,在低严谨尺度（low-stringency criteria）下,即良性肿瘤和恶性肿瘤患者都视为受累个体（affected individuals）,参数设定为:疾病等位基因频率（Disease allele frequency）0.0001,外显率（Penetrance）为AA=0.95,Aa=0.95,aa=0,发现染色体3q24-26为LOD值阳性区段,在SNPA-2277889-SNPA-19751583之间的SNP位点（位于q24-3q26.1）的优势对数（Log odds,LOD）值大于1.0,其中SNPA-2219474-SNPA-2106705之间的SNP（位于3q25.31）位点的LOD值达到了最大为2.382,提示该区段与多癌家系疾病位点连锁。在两点非参数连锁分析（Two-point non-parametric linkage analysis）中,染色体同一区段在SNPA-2053936-SNPA-2308707之间几个SNP位点（位于3q25.1-3q26.1）的LOD值大于1.0,SNPA-2056580-SNPA-2263975之间的SNP（位于3q25.2-3q25.32）位点的LOD值达到了最大为1.4（p=0.006）,与参数连锁分析结果一致。随后对这两种分析得到的阳性区段进行连锁不平衡（LinkageDisequilibrium,LD）建模（modeling）后,参数连锁分析LD modeling的结果仍大于2（之前为2.061）,非参数连锁分析LD modeling的结果仍大于1（之前为1.12）,排除了位点标记过多导致结果为假阳性的可能。我们曾尝试用芯片结果进行多点连锁分析（multi-piont linkageanalysis）,但都由于数据过大,计算量远远超出普通计算机的运算能力而被迫放弃。【微卫星精细扫描定位证实连锁】为了完成多点连锁分析,同时验证芯片的结果,本研究针对染色体3q24-26采用微卫星进行精细扫描定位。通过查询Marshfieldclinic数据库,在该区段一共选择了19个杂合度（Heterozygosity,H）在0.7以上的微卫星位点。对微卫星扫描结果进行基因分型,其中有3个位点在家系中杂合度低且分型不好判断故被舍弃,最终有16个参与了连锁分析计算。我们选择了GENEHUNTER软件进行了两点及多点的参数和非参数连锁分析,以及Linkage软件进行两点参数连锁分析。使用GENEHUNTER软件进行两点连锁分析,在D3S3625（位于3q25.1）得到了最大LOD值1.718和NPL值2.585（p=0.02161）,同时在下游位点D3S1607（位于3q25.32）处也得到了较高的LOD值为1.681和NPL值2.407（p=0.02161）。这与前期芯片分析结果没有明显差异,但通过随后的多点非参数连锁分析,却得到了非常有趣的发现。通过多点非参数连锁分析,在4.69-9.09cM（对应D3S3625-D3S3575共9个位点）处,LOD值超过了支持连锁的域值（3.0）,同时该区域非参数连锁分析均达到极显著连锁的水平P＜0.005,其中Multi-point NPL LOD值最高为10.674,包括两个位点D3S1584和D3S3710,对应p值最小（0.00195）。使用Linkage软件对微卫星数据进行两点参数连锁分析,其结果跟GENEHUNTER软件计算的结果完全一致。此外,采用GENEHUNTER软件和Cyrillic软件进行家系的单体型分析,从D3S1555-D3S3575的10个位点构成了一个连续的单体型（4-7-1-10-4-3-5-8-2-9）,在家系中与疾病共分离,其中患者Ⅳ-40、Ⅳ-1、Ⅳ-3、Ⅳ-4、Ⅳ-5、Ⅳ-18、Ⅴ-31、Ⅴ-30和非受累个体Ⅲ-7、Ⅳ-6、Ⅴ-2、Ⅴ-3、Ⅴ-4携带共同的单体型。【易感区段候选基因突变筛查】通过查询UCSC（University of California Santa Cruz）数据库和基因功能注释,首批选择了染色体3q24-26上12个肿瘤相关候选基因,采用基于直接测序的方法进行突变筛查。虽然没有发现明确的突变位点,不过目前在AADAC（arylacetamide deacetylase）基因Promoter区发现两个SNP位点rs16833935和rs8193024的特定基因型（分别为tt/tc和gg/ga）与癌家系的肿瘤发生共分离,两个SNP的特定基因型在家系患者/携带者（patients/carriers）和非携带者/外系（non-carrieers/spouse）中的分布差异有统计学意义（χ2=48,p＜0.0001）,提示这两个SNP位点的特定基因型可能与家系肿瘤发生有重要关系。进一步的研究工作将在当地人群中进行这两个SNP位点的大样本验证。同时将采用最新的针对3号染色体的靶向测序（Targeted sequencing）,期待能在突变位点的筛查上有所突破。此外,我们正着手在3q24-26易感区段以外,针对某些与多种肿瘤发病相关的重要癌基因、抑癌基因展开突变筛查。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩写词简表
• 第一章 前言
• 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 1.材料
• 1.1.遗传资源
• 1.2.主要仪器
• 1.3.主要试剂及试剂盒
• 1.4.耗材
• 1.5.引物及探针序列
• 1.6.数据分析统计
• 2.方法
• 2.1.基因组DNA抽提
• 2.2.SNP芯片全基因组扫描及相关数据处理
• 2.3.微卫星精细定位及相关数据处理
• 2.4.易感区段候选基因突变筛查方法及相关数据处理
• 第三章 结果
• 1.湖南多癌家系SNP芯片全基因组基因分型及相关分析
• 1.1.SNP芯片的基因分型
• 1.2.SNP芯片结果分析
• 2.连锁区段微卫星精细定位及连锁分析
• 2.1.微卫星位点的基因分型
• 2.2.微卫星位点的连锁分析
• 2.3.单体型分析结果
• 3.突变筛查
• 3.1.目的区段突变筛查
• 3.2.重要肿瘤易感基因突变筛查
• 第四章 讨论
• 1.多癌家系背景及特征分析
• 2.基于SNP芯片的全基因组扫描和基因分型是定位疾病易感区段的有效方法
• 3.基于家系的连锁分析策略在湖南罕见多癌家系易感基因定位克隆中的应用和意义
• 4.基于直接测序的易感基因突变筛查是阐明多癌家系肿瘤发病机制的根本方法
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附件
• 致谢
• 作者简介