生鲜牛奶污染布鲁菌和单增李斯特菌双重PCR方法的建立与应用及风险的初步解析

论文摘要

牛奶是重要的动物源性食品,同时也是人畜共患病的传染源。牛奶及奶制品很容易被病原微生物污染而危害人类健康,生鲜生奶在流通过程中可以传播多种疾病,例如布鲁菌病和李斯特菌病。布鲁菌是危害农场安全和人类健康的重要病原菌,感染布鲁菌的母牛在患病期间以及在流产后的很长时间内,仍可以通过乳汁排菌,产自病畜的牛奶是布鲁菌病由动物传播到人的重要传播媒介,食入含有布鲁菌的牛奶构成了公共卫生危害。单增李斯特菌是四大食源性致病菌之一,可以通过食物链导致人的感染。人感染单增李斯特菌的原因之一是由于食用了被污染的动物源性产品,牛奶和奶制品是两类传播李斯特菌病的重要途径,单增李斯特菌频繁的在奶牛场被检测到,对牛奶和奶制品安全构成了风险。因此,本研究通过建立牛奶中布鲁菌和单增李斯特菌的检测方法,围绕生鲜奶污染布鲁菌和单增李斯特菌的风险因素对奶牛场进行调查和解析,可以为我国制定牛奶安全保障措施提供科学依据。本试验获得了以下结果:(1)建立了生鲜牛奶中布鲁菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法,对污染模型乳用不同方式进行处理,布鲁菌和单增李斯特菌最低检测限分别为10 cfu/40mL和8 cfu/40mL。该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可单独或同时检测牛奶中布鲁菌和单增李斯特菌。(2)用已经建立好的检测方法检测采集的3739份生鲜牛奶样品,布鲁菌和单增李斯特菌的阳性率分别为0.29%和0.27%。试验结果为了解全国生鲜奶中布鲁菌和单增李斯特菌的污染状况提供了基础数据。(3)围绕生鲜牛奶污染布鲁菌和单增李斯特菌的风险因素对采样奶牛场进行调查,得到了在当前条件下我国奶牛场关于生鲜奶污染布鲁菌和单增李斯特菌风险因素相关的风险环节情况。(4)根据调查结果,对我国奶牛场的生鲜牛奶污染布鲁菌和单增李斯特菌的风险进行初步解析。当前,患布鲁菌病或有布鲁菌感染史的奶牛是生鲜牛奶污染布鲁菌的主要风险;较差的卫生条件和挤奶前处理不充分构成了生鲜奶污染单增李斯特菌的主要风险;不科学的储存方式加大了生鲜奶从环境中污染布鲁菌和单增李斯特菌以及单增李斯特菌在生鲜奶中增殖的风险。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 布鲁菌和单增李斯特菌检测方法概述
• 1.1 布鲁菌检测方法概述
• 1.2 单增李斯特菌检测方法概述
• 第二章 布鲁菌和单增李斯特菌污染和感染的风险因素研究进展
• 2.1 布鲁菌感染的风险因素
• 2.1.1 布鲁菌感染动物的风险因素
• 2.1.2 布鲁菌感染人的风险因素
• 2.2 单增李斯特菌污染和感染的风险因素
• 2.2.1 生鲜牛奶污染单增李斯特菌的风险因素
• 2.2.2 污染了单增李斯特菌的生鲜牛奶感染人的风险因素
• 试验研究
• 第三章 牛奶中布鲁菌和单增李斯特菌双重PCR 检测方法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法与步骤
• 3.2.1 引物设计与合成
• 3.2.2 模板制备
• 3.2.3 单PCR 扩增
• 3.2.4 双重PCR 扩增的条件和体系优化
• 3.2.5 双重PCR 方法特异性、敏感性、重复性的检测
• 3.2.6 双重PCR 方法对污染模型乳的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 单PCR 扩增结果
• 3.3.2 PCR 扩增产物鉴定结果
• 3.3.3 双重PCR 扩增条件优化结果
• 3.3.4 双重PCR 方法特异性、敏感性、重复性的检测结果
• 3.3.5 双重PCR 方法对污染模型乳的检测结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 生鲜牛奶样品布鲁菌和单增李斯特菌的检测
• 4.1 奶牛场样品采集
• 4.1.1 抽样方法的选择
• 4.1.2 采样原则
• 4.1.3 采样所需材料
• 4.1.4 采样方法步骤
• 4.2 样品检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 一级样本区域划分结果
• 4.3.2 采样省份结果
• 4.3.3 采样奶牛场信息及检测结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 布鲁菌污染情况
• 4.4.2 单增李斯特菌污染情况
• 4.5 小结
• 第五章 生鲜牛奶污染布鲁菌和单增李斯特菌风险的初步解析
• 5.1 方法步骤
• 5.1.1 围绕风险因素对奶牛场的调查
• 5.1.2 污染风险的初步解析
• 5.2 结果
• 5.2.1 奶牛场相关信息调查结果
• 5.2.2 污染风险初步解析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 内源性污染途径解析
• 5.3.2 环境污染途径解析
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介