天花粉蛋白基因的克隆及其突变体在大肠杆菌中的表达

论文摘要

目的：天花粉蛋白（TCS）是一种单链核糖体失活蛋白，它能抑制真核生物蛋白质合成，并具有广谱的抗病毒活性。近期研究发现TCS可专一性地杀死被HIV感染的细胞，而对正常细胞无作用。本实验利用PCR技术从栝楼基因组DNA中扩增出TCS基因，成功构建了克隆载体和表达载体，并建立了TCS随机突变文库，这为TCS的原核表达奠定了分子生物学的基础。方法：1)．从新鲜栝楼叶片中获取TCS基因组DNA，利用PCR技术扩增其全长基因，与载体pUCm-T连接，转化感受态E．coli DH5α，提取质粒进行测序；2)．用PCR法克隆TCS成熟肽基因（CDS），经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后连接经同样双酶切的pET-28α（+）载体，转化E．coli DH5α，阳性鉴定后将所获阳性重组质粒转化感受态E．coli BL21（DE3）得到工程茵，经IPTG诱导表达后，对表达产物进行SDS-PAGE分析；3)．采用易错PCR技术构建TCS基因和活性中心随机突变文库，用IPTG诱导原核表达后，产物进行SDS-PAGE分析。结果：成功克隆TCS基因并构建了TCS重组质粒；TCS原核表达成功，经SDS-PAGE分析特征条带明显；构建了TCS基因和活性中心随机突变文库。结论：TCS基因和活性中心随机突变文库的建立和在大肠杆菌中的表达与纯化，为通过基因工程方法研制、筛选具有抗HIV活性的药物奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、天花粉蛋白的结构
• 二、天花粉蛋白基因的结构及表达
• 三、TCS的功能及作用机制
• 四、展望
• 材料方法
• 1 材料
• 2 方法
• 3 试验步骤
• 第一步、栝楼基因组DNA的提取与TCS基因的克隆
• 第二步、TCS成熟肽基因（CDS）的表达
• 第三步、TCS成熟肽DNA序列的随机突变及突变文库的构建和表达
• 第四步、TCS活性中心随机突变文库的构建和突变体的表达
• 实验结果
• 一、栝楼基因组DNA的提取和TCS基因的克隆与表达
• 二、TCS基因随随机突变文库的构建和突变体基因的诱导表达
• 三、TCS基因活性中心DNA序列随机突变文库的构建和突变基因的表达
• 讨论
• 1.研究天花粉蛋白并构建TCS随机突变文库的意义
• 2.研究过程中遇到的问题及解决方法
• 3.取得的成果及展望
• 4.本次实验的不足及原因分析
• 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢