龙眼（Dimocarpus longan Lour.）在酸雨胁迫下Ca信号传递及蛋白表达的初步研究

论文摘要

本研究以一年生乌龙岭龙眼幼苗为材料，研究了酸雨胁迫下叶片CaM含量、H+-ATPase和Ca2+-ATPasc活性的变化、叶片特异蛋白的表达以及外源Ca2+的作用，探讨了龙眼叶片对酸雨胁迫的信息感受和传递机制。主要研究结果如下：1．优化了ELISA测龙眼叶片CaM含量的条件，结果表明，龙眼叶片的最佳的包被抗原浓度为5μg／ml，适宜的一抗稀释比例为1：3000，最适宜稀释倍数为40。2．不同的胁迫强度和胁迫时间影响叶片CaM含量、H+-ATPase和Ca2+-ATPasc活性的变化。在整个胁迫的过程中，CaM含量呈反复上升下降的变化趋势，但随着胁迫时间的延长，CaM含量的变化幅度逐渐下降。龙眼叶片胞质Ca2+-ATPase与H+-ATPase的活性对酸雨非常敏感，伴随模拟酸雨强度的加大其活性受到抑制。其原因可能是：细胞内较高浓度的H+的长期胁迫下，Ca-CaM信使系统逐渐受到破坏，ATP酶活性下降，导致了植物的抗性逐渐下降。3．当外源喷施10 mmol／L Ca（NO3）2作用于酸雨胁迫下的龙眼幼苗时，CaM含量、H+-ATPase和Ca2+-ATPasc活性均比无Ca（NO3）2处理高；Ca2+螯合剂EGTA则使CaM含量下降、H+-ATPase和Ca2+=ATPasc活性降低。CPZ能抑制H+-ATPasc和Ca2+-ATPase的活性。说明Ca-CaM系统在酸雨胁迫下起到信号传递的作用，Ca2+-ATPase和H+-ATPase的活性受CaM激活和调节，而喷施外源Ca2+则能促进信号传递的过程。4．利用Bio-rad公司的蛋白质图谱分析软件Quantity one和PDQuest对电泳图谱进行分析处理，得到的图谱背景清晰同时保持了数据的完整性。在本研究中，利用Quantity one软件计算SDS-PAGE图谱中蛋白质条带的分子量，并对不同处理组进行差异分析，得到各个处理间的相似率。利用PDQuest对2-DE电泳图谱进行处理，经过背景消减、点检测和匹配后，得到背景清晰的2-DE图谱、每张凝胶的蛋白点数以及差异蛋白点。5．利用SDS-PAGE分析酸雨胁迫下龙眼叶片特异蛋白的表达。从SDS-PAGE图谱可以看出，pH2.5酸雨胁迫15d后，分子量大约为23KD的蛋白特异表达，20d后，分子量大约为17KD蛋白表达增强。与pH2.5相比，pH3.5的酸雨对龙眼幼苗叶片蛋白表达影响较弱，但随着胁迫时间的增加，表达差异呈上升的趋势6．利用蛋白质双向电泳（2-DE）技术对样品进行进一步分析。结果表明，酸雨胁迫后特异表达的蛋白质组分有6个，其中C4（20.2KD pI6.0）在不同酸度酸雨的整个胁迫过程中表达，F（24KD pI6.35）在pH2.5酸雨胁迫15d后开始表达，20d后，在不同处理下均有表达，蛋白B3（22.3KD pI6.35）、B4（23.5KD pI6.5）、C5（21.8KDpI5.6）、C6（20.2KD pI5.6）的表达则与酸雨酸度、胁迫强度有关。蛋白B4（23.5KDpI6.5）仅在有外源Ca2+的处理组中表达，说明外源Ca2+与蛋白B4的表达有某种相关性。7．通过SDS-PAGE与2-DE分析发现，EGTA和CPZ处理下，有4个蛋白质组分表达增强，推测这4个蛋白质组分与龙眼响应酸雨胁迫的Ca-CaM系统有相关性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 酸雨概况
• 2 酸雨对植物影响研究进展
• 2.1 酸雨对植物影响的表现
• 2.2 酸雨对植物影响的机理
• 3 植物钙-钙调蛋白（Ca·CaM）系统研究进展
• 3.1 植物细胞钙离子研究进展
• 3.2 CaM的基本特征和生理功能
• 3.3 钙信使系统调节的酶类
• 3.4 钙信使系统在植物逆境反应中的作用
• 4 植物蛋白质组学研究进展
• 4.1 蛋白质双向电泳技术
• 4.2 逆境胁迫下植物蛋白质组学研究进展
• 第二章 模拟酸雨胁迫下龙眼叶片Ca-CaM信号系统
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与酸雨胁迫处理
• 1.2 实验药品与试剂
• 1.3 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 竞争ELISA法测CaM含量
• 2.2 模拟酸雨对龙眼叶片CaM含量的影响及钙调节
• 2+-ATPase活性变化及钙调节'>2.3 模拟酸雨胁迫下龙眼叶片胞质Ca²⁺-ATPase活性变化及钙调节
• +-ATPase活性变化及钙调节'>2.4 模拟酸雨胁迫下龙眼叶片胞质H⁺-ATPase活性变化及钙调节
• 3 讨论
• 2+-ATPase、H⁺-ATPase活性的影响'>3.1 酸雨对CaM含量和Ca²⁺-ATPase、H⁺-ATPase活性的影响
• 2+-ATPase和H⁺-ATPase活性的影响'>3.2 外源钙离子和EGTA、CPZ对CaM含量、Ca²⁺-ATPase和H⁺-ATPase活性的影响
• 第三章 模拟酸雨胁迫下龙眼叶片特异蛋白的表达与钙调节
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料与模拟酸雨胁迫处理
• 1.2 试验药品
• 1.3 龙眼叶片蛋白质的提取
• 1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.5 双向电泳（2-DE）
• 2 结果与分析
• 2.1 模拟酸雨胁迫下龙眼叶片蛋白质含量的变化及钙调节
• 2.2 不同染色方法的对比
• 2.3 不同pH梯度范围的分离结果比较
• 2.4 利用Quantityone软件分析SDS-PAGE图像
• 2.5 利用PDQuest8.0软件分析双向电泳图像
• 2.6 酸雨胁迫下龙眼叶片特异蛋白的变化及钙调节
• 3 讨论
• 总结
• 1 结论
• 2 研究展望
• 附录
• 图版说明
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间发表的相关论文