论文摘要
第一部分中国急性髓性白血病患者MDM2和p53基因多态性的研究研究目的:在50%以上的人类肿瘤组织中均检测到p53抑癌基因的突变。因此,p53介导的通路中重要基因的遗传变异将会影响个体的肿瘤易感性。p53受MDM2蛋白的精密调控,该蛋白是p53通路中的一个重要的负性调节因子。已知MDM2和p53基因上存在一些SNP位点,其中位于启动子区内的MDM2 SNP309T＞G位点和位于编码区的p53第72位密码子备受关注。MDM2基因的SNP309位点的变异可提高MDM2的mRNA和蛋白质表达水平,从而减弱p53的肿瘤抑制作用。而p53基因的第72位密码子具有CGC/CCC多态性,使编码的精氨酸（Arg）被脯氨酸（Pro）取代。研究还发现这二个SNP位点都与肿瘤的遗传易感性、癌变的演进及预后有关。我们探讨了MDM2 SNP309和p53第72位密码子多态性与急性髓系白血病的关系。研究方法:采用等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR,allele-specificpolymerase chain reaction）和聚合酶链反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP,polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism）检测231例急性髓系白血病病人及128例正常人的MDM2 SNP309和p53第72位密码子多态性的基因分型。拟和优化x2检验分析正常人基因分布频率是否符合Hardy-Weinberg平衡。用非参数检验分析病人MDM2和p53的基因分型与各种临床特征（年龄、性别、细胞遗传学风险、起始白血病计数等）的关联,以非条件Logistic回归模型计算表示相对风险度的比值比（odds rations,OR）及其95%可信区间（confidentialinterval,CI）,OR值以年龄校正。对基因-基因交互作用的进一步分析采用基于相乘模型的叉生分析法,交互效应（OR）即为基因和基因联合作用效应。以P＜0.05定为有统计学意义,采用SPSS13.0统计软件包进行数据统计分析。结果:正常人群MDM2和p53基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。在急性髓系白血病组中,携带MDM2 SNP309 GG基因型的频率（33.2%）显著高于正常对照组（19.5%）,与SNP309 TT基因型相比,携带SNP309 GG基因型可增加急性髓系白血病的发病风险,经年龄校正后的OR值为（OR=3.52,95%CI=1.80-6.87）。MDM2和p53的各种基因型在急性髓系白血病人群的临床特征均无统计学意义。叉生分析显示,MDM2和p53两基因型对急性髓性白血病的发病并无交互作用。结论:MDM2 SNP309 GG等位基因可能对急性髓系白血病的发病风险起作用。第二部分白血病细胞系MDM2基因多态性与化疗药物的研究研究目的:DNR和VP-16在白血病治疗中发挥重要的作用。许多细胞周期调控蛋白都参与了VP-16诱导的凋亡。比如在脐带CD34阳性细胞中发现p53、C-Myc和BAFF参与VP-16诱导的凋亡并阻止细胞周期进程。VP-16可通过p53途径或独立于p53的途径来阻断G2→M期。DNR也通过复杂的信号途径促进凋亡和细胞死亡。我们这次研究的目的就是阐明是否MDM2 SNP309位点的改变会影响白血病细胞系对化疗药物的耐药性。研究方法:通过PCR扩增以及测序技术鉴定白血病细胞系的MDM2 SNP309基因多态性以及p53的突变情况。分别用DNR和VP-16对白血病细胞系进行药物处理,通过MTT的方法检测药物对细胞系的增殖能力的影响。通过DNA ladder电泳分析以及Annexin V法检测药物对细胞系的凋亡的影响。结果:我们发现MDM2 SNP位点的改变并不影响白血病细胞系的增殖能力,然而,DNA ladder电泳分析显示携带MDM2 SNP309的TT基因型的白血病细胞系对DNR和VP-16诱导的凋亡更敏感。结论:MDM2 SNP309位点可能通过凋亡途径影响白血病细胞系对化疗药物的敏感性。第三部分AML1及AML1-ETO对MDM2表达的调控作用研究目的:观察AML1和AML1-ETO融合基因对不同的SNP309位点MDM2 P2启动子转录活性的影响,探讨AML1-ETO促进白血病发生的机制。研究方法:构建含不同SNP309位点的MDM2 P2启动子的报告质粒,与AML1-ETO、AML1以及SP1的表达质粒单独或共转染CV-1细胞,测定荧光素酶的活性,分析AML1-ETO、AML1以及SP1对MDM2 P2启动子的影响。结果:在CV-1细胞中,AML1-ETO在一定浓度范围（50-500ng）内,pGL3-MDM2G-Basic载体相对于pGL3-MDM2 T-Basic载体的Luciferase表达量有1.2-4倍的降低。而AML1对不同的SNP309位点的MDM2 P2启动子的转录调控作用并无显著性差别。将AML1-ETO与固定剂量的SP1分别与含有不同的SNP309位点的MDM2P2启动子报告基因载体共转染,发现SNP309 GG启动子的报告基因的Luciferase表达量明显下调,且没有剂量依赖性。而SNP309 TT启动子的报告基因Luciferase表达量反而上升,但随着AML1-ETO剂量的增加,Luciferase表达量下降。结论:AML1-ETO可能会通过MDM2 P2启动子SNP309位点影响转录调控。
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