IgG型抗dsDNA抗体和钙网蛋白在狼疮肾炎中的作用

论文摘要

研究背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种典型的自身免疫性结缔组织疾病,突出表现为体内辅助性T淋巴细胞和多克隆B淋巴细胞高度活化,产生大量自身抗体,造成全身多系统、多脏器的损害,尤其是肾脏损害和神经系统损害。20世纪50年代之前,由于对SLE认识的有限,以及诊断技术的落后,人们一直以为SLE是一种罕见病,随着LE细胞实验用于SLE的诊断,以及诊断标准的不断完善,尤其是1982年和1997年的美国风湿病学会对SLE诊断标准进行修订后,发现SLE的发病率高于人们的想象,且有不断升高的趋势。SLE广泛分布于世界各地,全球SLE患病率约为17/10万～48/10万,我国SLE患病率介于40/10万～70/10万之间,略高于西方国家。目前,对该病的治疗依然存在困难,临床上多采用皮质激素、免疫抑制剂和抗疟药物来控制患者的病情发展,绝大多数患者需要终身服药治疗,结果部分患者并非死于本病,而死于药物治疗带来的副作用。SLE的临床表现各异,不同病人、同一病人不同时期的临床表现变化较大,患者可表现为红斑性皮炎、多关节炎、多浆膜炎、贫血、血小板减少、心、肝、肺、肾和神经系统等的异常,其中肾脏受累最为常见。其中40%～70%的SLE患者在发病后5年内会发展为狼疮性肾炎。SLE的病因和发病机制至今未明,可能与遗传、感染、环境、性激素和药物等诸多因素有关。自身免疫耐受,自身抗体产生并介导器官/系统损害是其主要发病机制。在确诊的SLE患者中,临床表现出明显肾损害者占40%75%,多数发生于SLE发病后5年内,且有20%左右的SLE患者以狼疮肾炎（lupus nephritis, LN）为首发临床表现。肾脏损害的严重程度是直接影响SLE预后的重要因素,肾损害和进行性肾衰竭是SLE的主要死亡原因之一。SLE患者淋巴细胞凋亡增多,导致血液循环核小体增多,暴露出更多的隐蔽自身抗原,诱发机体产生许多自身抗体。自身抗体中抗DNA抗体是SLE的标志性抗体,特别是高亲和力的IgG型抗dsDNA抗体在狼疮肾炎的发病机制中发挥很大作用。起初人们认为狼疮肾炎是由DNA-抗DNA抗体的循环免疫复合物经过血循环沉积在肾脏上引起炎症和脏器损害的,尽管一些证据也证实了这一点,但是并未得到所有研究者的认可。同时,也有许多研究者认为,狼疮肾炎是由可溶性抗原（DNA或者核小体）预先种植在肾小球基底膜（GBM）上再与抗dsDNA抗体结合形成原位免疫复合物沉积。这两种假说并不相互排斥,而且各有理论依据,但是亦有各自的缺陷: Rekvig等认为,在SLE患者体内普遍存在抗dsDNA抗体,但并非所有的抗dsDNA抗体阳性患者都患有狼疮肾炎,循环免疫复合物的水平与狼疮肾炎的活动性似乎并不密切等等。因此,狼疮肾炎的发病机制仍需进一步研究,需用一种新的思路去解决上述两种假说的不足。Putterman等报道,在动物试验和体外试验中均可发现IgG型抗dsDNA抗体的一些亚型能够穿透活细胞,引起细胞功能紊乱,并且这种细胞穿透作用在SLE的发病中起着重要作用。抗dsDNA抗体的一些亚型能够穿透活细胞的学说也许能够解释前两种假说所不能解释的现象。IgG型抗dsDNA抗体不仅容易穿透肾小球细胞,也容易穿透肾小管细胞、肝细胞、神经元细胞、纤维母细胞和单核细胞等。穿透性抗体一般先结合于细胞表面,然后再进入胞质或定位于细胞核上,并且这种细胞定位一般需要膜受体介导。IgG型抗dsDNA抗体的细胞膜受体有很多种类,促使细胞穿透很容易发生。Puttemianm发现小鼠抗dsDNAIgG抗体（F14.6,J20.8,H9.3,F4.1）能结合在红细胞（K562）,T细胞（CEM和Jurkat） , B细胞（Raji）表面,随培养时间的延长,细胞内F14.6,J20.8浓度逐渐增加,经处理可得到一种大约50KD的膜蛋白,测序后确定是钙网蛋白（CRT）。推测CRT是抗dsDNA抗体的细胞表面受体,介导其进入细胞。SLE患者体内产生具有穿透活细胞能力的IgG型抗dsDNA抗体后,可以选择性的与靶细胞上面的蛋白受体结合,由受体介导穿入细胞内和细胞内靶目标结合发挥其生物学作用,导致细胞功能紊乱:一方面可以导致肾小球细胞等增殖增生,组织器官发生病理改变而发挥致病作用;另一方面可以导致淋巴细胞凋亡增加,产生大量的核小体,进一步促使自身抗体的产生,促使疾病恶化。因此我们假设SLE患者体内的IgG型抗dsDNA抗体能选择性的穿透肾脏组织的活细胞引起肾脏器官发生损害,可能与SLE患者体内具有细胞穿透能力的IgG型抗dsDNA抗体水平高有关,也可能与肾脏组织的钙网蛋白表达增多有关。正是基于此种差异,才会导致部分抗dsDNA抗体阳性的SLE患者会发生狼疮肾炎,而部分患者甚至无肾脏损害表现。因此,我们拟在已取得研究基础上,通过病例对照研究收集生物学标本,采用血清学检测、肾组织活检相结合,了解血清中IgG型抗dsDNA抗体各亚型的滴度与狼疮肾炎的关联性,分析肾组织上钙网蛋白受体的表达,为最终阐明自身抗体介导的狼疮肾炎发病的分子机制提供依据。目的比较狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）患者和非狼疮肾炎的系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者血清IgG抗dsDNA抗体及其亚型的分布,以及狼疮肾炎患者肾组织IgG亚型和钙网蛋白的分布。探讨抗dsDNA抗体与狼疮肾炎病理间的关系,阐述IgG1型、IgG2型、IgG3型和IgG4型抗dsDNA抗体水平与狼疮肾炎发生的关系。确定外周血游离的4种IgG型抗dsDNA抗体的水平与狼疮肾炎患者活动性/慢性指数的关系,为狼疮肾炎的早期诊断和制定治疗方案提供依据。阐述IgG型抗dsDNA抗体与钙网蛋白在狼疮肾炎发生中的作用。方法以健康个体为正常对照组,病例组选自两所三甲医院住院的SLE患者,其中病例组又分为狼疮肾炎和非狼疮肾炎两组,参照系统性红斑狼疮疾病活动性指数、病理分级、狼疮肾炎活动性和狼疮肾炎慢性指标,设计问卷,收集患者的一般情况和疾病情况。采用双抗夹心酶联免疫吸附试验测定研究对象外周血IgG型抗dsDNA抗体及其亚型,采用免疫组化法检测狼疮肾炎患者肾组织IgG亚型以及钙网蛋白的分布。采用SPSS 10.0进行统计分析。结果SLE患者（n=60）与正常人（n=60）相比,血清IgG型抗dsDNA抗体差异有显著性（χ2=31.16,P<0.001）,但是SLE非LN患者（n=32）与LN患者（n=28）间相比,血清IgG型抗dsDNA抗体差异无显著性（χ2=0.021,P=0.885） 32例非狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者有11例血清IgG1型抗dsDNA抗体呈现阳性,1例血清IgG2型抗dsDNA抗体呈现阳性,8例血清IgG3型抗dsDNA抗体呈现阳性,28例狼疮肾炎患者依次为18例,17例和8例。血清IgG1（χ2=5.35,P=0.021）和IgG2（χ2=5.24,P=0.022）在非LN的SLE患者与LN患者两组中的分布差异具有显著性,而血清IgG3差异无统计学意义（χ2=0.09,P=0.755）,两组间均未检测到血清IgG4亚型。60例SLE患者中,活动期的SLE患者（n=36）的血清IgG型抗dsDNA抗体阳性率高于非活动期的SLE患者（n=24）,差异具有统计学意义（χ2=4.57,P=0.033）。进一步对其亚型进行分析发现,活动期的SLE患者（n=36）的血清IgG2型抗dsDNA抗体阳性率高于非活动期的SLE患者（n=24）,差异具有统计学意义（χ2=4.05,P=0.044）,而活动期的SLE患者（n=36）的血清IgG1、IgG3型抗dsDNA抗体阳性率与非活动期的SLE患者（n=24）相比,差异无统计学意义（χ2=1.88,P=0.170;χ2=0.13,P=0.721）。32例非狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者中,活动期的非LN SLE患者（n=16）与非活动期（n=16）相比,血清IgG抗dsDNA抗体3种亚型间的差异均无统计学意义（χ2=0.14,P=0.710;χ2=0.00,P=1.000;χ2=0.67,P=0.414）。而28例狼疮肾炎患者中,活动期的LN患者（n=20）与非活动期（n=8）相比,血清IgG2抗dsDNA抗体阳性率差异具有显著性（χ2=5.99,P=0.014）,血清IgG1和IgG3抗dsDNA抗体差异无统计学意义（χ2=3.50,P=0.061;χ2=2.52,P=0.112）。28例LN患者分类如下:I型1例（3.6%）,II型5例（17.9%）, III型10（35.7%）,IV型11（39.3%）,V型1例（3.6%）。肾脏以外症状以关节炎（50.0%）、脱发（50.0%）、颧部红斑（28.6%）为多见,但各症状病理类型分布相同,差异无统计学意义。抗dsDNA抗体阳性组中以WHO III、IV型为多,而抗dsDNA抗体阴性组中以WHO I、II型为多,并且差异无统计学意义,各个亚型分析的结果也相同。抗dsDNA抗体阳性组,其蛋白尿、血尿、氮质血症均较抗dsDNA抗体阴性组多见,但仅氮质血症差异具有统计学意义。IgG1抗dsDNA抗体亚型阳性组氮质血症差异具有统计学意义,IgG2型阳性组血尿差异具有统计学意义。血清总IgG抗dsDNA抗体与狼疮肾炎活动性指标（Spearman r = -0.464,P =0.017）和慢性指标（Spearman r = -0.508, P =0.013）有关,在其亚型中,仅见IgG2亚型与狼疮肾炎活动性指标（Spearman r = -0.475, P =0.011）有关,而未见各个亚型与慢性指标有关。在28份狼疮肾炎肾组织中,均可检测到四种IgG亚型,且血清抗dsDNA抗体亚型与狼疮肾炎患者肾组织IgG亚型无关。钙网蛋白在狼疮肾炎的WHO五种分型之间,差异具有显著性（χ2=9.475 ,P=0.021）,钙网蛋白的表达与狼疮肾炎活动性呈正相关（Spearman r = 0.973, P <0.001）,而与慢性指标无关（Spearman r = 0.320, P =0.097）。钙网蛋白与血清抗dsDNA抗体相关（Spearman r = -0.504, P =0.006）。结论SLE患者血清IgG抗dsDNA抗体高于正常对照组,非LN患者与LN患者相比,IgG抗ds-DNA抗体亚型存在差异。IgG1和IgG2升高可能参与了狼疮肾炎的发病,且IgG2与其活动性呈正相关,可反映疾病的严重程度,在临床诊断上具有一定的价值。血清抗dsDNA抗体与狼疮肾炎临床活动性指数相关,可以作为狼疮肾炎活动的指标。钙网蛋白的表达与血清IgG型抗dsDNA抗体、狼疮肾炎活动性呈正相关,可能作为血清IgG型抗dsDNA抗体的受体参与狼疮肾炎的发病。

论文目录

• 英文缩略词
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• 英文摘要
• 正文IgG 型抗dsDNA 抗体与钙网蛋白在狼疮肾炎中的作用
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 研究对象
• 2.2 临床资料收集
• 2.3 标本收集
• 2.4 实验方法及步骤
• 2.4.1 IgG 型抗dsDNA 抗体检测
• 2.4.2 IgG 型抗dsDNA 抗体亚型检测
• 2.4.3 肾组织处理
• 2.4.4 肾组织IgG 亚类检测
• 2.4.5 肾组织钙网蛋白检测
• 2.5 统计学方法
• 2.6 质量控制
• 3 结果
• 3.1 患者和对照的一般情况和临床资料情况
• 3.2 血清 IgG 型抗dsDNA 抗体水平与SLE 的关系
• 3.2.1 血清IgG 型抗dsDNA 抗体水平分布情况
• 3.2.2 血清IgG 型抗dsDNA 抗体亚型的分布情况
• 3.2.3 血清IgG 型抗dsDNA 抗体及其亚型与SLE 患者疾病活动度之间的关系
• 3.2.4 血清IgG 型抗dsDNA 抗体及其亚型与患者主要临床表现之间的关系
• 3.3 狼疮肾炎患者肾组织检测
• 3.3.1 病理类型情况
• 3.3.2 狼疮肾炎患者肾组织IgG 亚型的分布
• 3.3.3 血清抗dsDNA 抗体与狼疮肾炎病理间的关系
• 3.3.4 狼疮肾炎患者肾组织钙网蛋白的分布
• 4 讨论
• 4.1 血清IgG 抗dsDNA 抗体及其亚型在狼疮肾炎发病中的作用
• 4.2 血清IgG 抗dsDNA 抗体及其亚型与狼疮肾炎临床表现的关系
• 4.3 血清IgG 抗dsDNA 抗体及其亚型与狼疮肾炎病理的关系
• 4.4 钙网蛋白与狼疮肾炎的关系
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 附录
• 1. 个人简历
• 2. 在读期间出版的专著以及发表和待发表的文章
• 3. 在读期间完成的工作
• 4. 在读期间参加工作经历
• 5. 在读期间所获奖励
• 致谢
• 综述
• 附一 系统性红斑狼疮患者调查表
• 附二 知情同意书