论文题目: CD4～+CD25～+调节性T细胞在肺癌免疫逃逸机制中的作用初探
论文类型: 博士论文
论文专业: 内科学呼吸系病
作者: 张晓菊
导师: 白明
关键词: 调节性细胞,肺癌,转化生长因子,叉状头,翅膀状螺旋转录因子,肿瘤浸润淋巴细胞,白细胞介素受体,可溶性白细胞介素受体
文献来源: 华中科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 随着免疫学、分子生物学及基因生物工程技术的发展，以肿瘤免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已成为继手术、化疗、放疗治疗肿瘤的新模式。大量研究提示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身都处于耐受或缺陷状态，肿瘤在逃逸机体的免疫机制之后才得以继续进展。新近发现有一个有独特免疫调节功能的T细胞亚群：CD4+CD25+调节性T细胞，参与了肿瘤免疫耐受机制，这类细胞具有免疫抑制及免疫无能等特性。其免疫无能表现在对高浓度IL-2的单独刺激，固相包被、可溶性抗CD3单抗以及抗CD3单抗和抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态，也不能分泌IL-2；其免疫抑制性表现在经TCR（或者抗CD3抗体）被活化后能够抑制CD4+和CD8+T细胞的IL-2转录与表达，从而干扰其活化与增殖。CD4+CD25+调节性T细胞在体外发挥免疫抑制作用时没有MHC限制性，能够抑制同种同型或者同种异型T细胞的增殖，即具有抗原特异性，一旦激活后其抑制活性是非特异的，可能通过细胞直接接触，细胞因子分泌等抑制CD4+和CD8+等T细胞的活化和增殖。基于上述研究及理论基础，本实验将探讨CD4+CD25+调节性T细胞在肺癌局部和全身免疫中的作用机制，通过检测全身或局部CD4+CD25+调节性T细胞的分布状况，模拟肺癌微环境进一步研究CD4+CD25+调节性T细胞的作用机制。旨在为肺癌的生物治疗提供新的切入点。第一部分肺癌患者CD4+CD25+调节性T细胞的检测及意义目的：应用流式细胞仪技术检测肺癌患者外周血及肺癌组织局部的CD4+CD25+调节性T细胞的分布并探讨相关机制。方法：46例肺癌患者外周血经Ficoll梯度离心分离单个核细胞，21例肺癌切除组织采用酶消化法原代分离肺癌细胞及浸润淋巴细胞，抗体标记后应用流式细胞仪分析CD4+CD25+调节性T细胞的比例，并以20例健康对照者外周血CD4+CD25+调节性T细胞比例为对照。比较46例不同病理类型、不同分期的肺癌外周血CD4+CD25+调节性T细胞的分布比例，并用ELISA方法检测同标本血中TGF-β1的浓度。结果：46例肺癌患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞比例为（12.1±2.3）％，21例肺癌局部组织CD4+CD25+调节性T细胞比例为（21.8±3.4）％，同正常对照组（4.1±0.6）％相比，差异均有显著性意义（P均＜0.05）。46例肺癌患者中22例鳞癌，19例腺癌，5例小细胞癌，患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞比例显著升高，分别（12.1±0.9）％，（10.8±0.4）％，（11.2±0.4）％，明显高于健康对照组（4.1±0.6）％（P＜0.05）；但不同病理类型的各肺癌组之间，其CD4+CD25+比例无明显差异（P＞0.05）；在不同分期的肺癌患者，20例Ⅲ、15例Ⅳ晚期肺癌患者外周血中CD4+CD25+比率为（11.4±2.1％、12.1±1.3％）明显高于11例Ⅱ期患者（8.6±1.5％），均高于健康对照组（P＜0.05）。TGF-β1的检测显示，肺癌组外周血清中TGF-β1的水平显著高于健康对照组（P＜0.05）。但在不同病理类型之间无显著差异（P＞0.05）。结论：肺癌患者全身或局部均有调节性T细胞比例增高，且与分期有关。提示肺癌患者体内存在免疫异常。推测可能参与了肺癌的发生与发展。第二部分Foxp3在肺癌组织中的表达及相关意义探讨目的：检测FOXP3在不同病变肺组织中的表达，由此分析CD4+CD25+调节性T细胞在不同病变肺组织中的浸润情况，并进一步探讨不同病理类型的肺癌组织中FOXP3表达的异同。方法：对21例肺癌，7例支气管扩张，5例炎性假瘤，3例结核球以及15例病灶旁正常手术切除肺组织123份标本使用RT-PCR及Western-blot方法，以正常肺组织、良性病变肺组织为对照，分析不同病理类型肺癌组织中FOXP3mRNA及蛋白的表达。结果：肺癌、肺良性病变及病灶旁正常肺组织FOXP3mRNA及蛋白的表达阳性分别为41／63、8／45、0／45（P＜0.05），肺癌与肺良性病变组织均有FOXP3mRNA及蛋白表达，分析其平均吸光度A值之间有显著性差异（P＜0.05）。病灶旁正常肺组织FOXP3mRNA及蛋白无表达。不同病理类型的肺癌组织中均有FOXP3mRNA及蛋白的表达，分析其平均吸光度A值之间无显著性差异（P＞0.05）。结论：FOXP3可作为CD4+CD25+调节性T细胞的一种标志物。肺癌与肺良性病变组织均有FOXP3mRNA及蛋白表达，FOXP3在肺癌组织中表达强于肺良性病变组织，提示无论良恶性病变均有CD4+CD25+调节性T细胞的浸润等免疫机制的参与，在恶性发病机制中有更强的CD4+CD25+调节性T细胞的作用参与。第三部分TGF-β1参与肺癌CD4+CD25+调节性T细胞比例增高的机制初探目的：探讨在与肺癌细胞直接接触与非直接接触环境下，TGF-β1在肺癌患者CD4+CD25+调节性T细胞比例增高中可能发挥的机制。方法：肺癌手术切除组织采用酶消化法原代分离肺癌细胞，将原代培养的肺癌细胞及肺癌细胞培养上清液分别与同种来源的外周血单个核细胞共培养并分组，给予不同浓度的TGF-β1干预，TGF-β1浓度分别为2，5，10ng／ml，检测各组CD4+CD25+调节性T细胞标志物FOXP3mRNA的表达，并探讨内在的相关性。结果：各组均有FOXP3mRNA的表达，原代培养的肺癌细胞与同种来源外周血单个核细胞培养其上清液TGF-β1浓度为（1.4±0.7ng／ml），加入不同浓度的TGF-β1干预后，且随着TGF-β1干预浓度的增加，FOXP3mRNA的表达强度逐渐增高，两者呈正相关（r=0.0871，p＜0.01）；外周血单个核细胞与肺癌细胞培养上清液共培养亦有FOXP3mRNA的表达，经TGF-β1干预后，各组间FOXP3mRNA的表达均有上调但各组间并无明显差异（P＜0.05）。结论：TGF-β1能调节单个核细胞中FOXP3表达增加，即上调CD4+CD25+调节性T细胞的比例，从而在肺癌免疫逃逸机制中发挥一定的作用，在与肺癌细胞直接接触的环境中，经TGF-β1干预单个核细胞中FOXP3表达上调更为显著，提示细胞直接接触参与了肿瘤局部免疫抑制的机制。第四部分外源性IL-2对恶性胸腔积液中肿瘤浸润淋巴细胞增殖的机制研究目的：检测肺癌患者恶性胸腔积液sIL-2R浓度及TIL表面IL-2Rα链（CD25）的表达，观察给予外源性IL-2后恶性胸腔积液TIL表面IL-2Rα的表达变化，同时检测CD8+TIL的比例，探讨恶性胸腔积液SIL-2R浓度与TIL表面IL-2Rα链表达的相关性，评价生物治疗对肺癌伴恶性胸腔积液患者局部免疫的影响机制。方法：34例肺癌并恶性胸腔积液患者于第一次抽液时留取胸腔积液，ELISA法检测sIL-2R浓度，Ficoll梯度离心分离单个核细胞，抗体标记后应用流式细胞仪分析TIL表面表达IL-2Rα链及CD8+TIL的比例；给予外源性IL-2（英路因）100万u胸内注射一周后再次留取胸腔积液按上述方法进行各项指标的检测；以sIL-2R浓度中位数为界分高浓度、低浓度两组，用SPSS13.0统计软件进行数据分析。结果：（1）无论高浓度组还是低浓度组：IL-2干预前恶性胸腔积液中sIL-2R浓度与TIL表面IL-2Rα链的表达有明显的正相关关系（r分别为1.123，0.872，P均＜0.05），高浓度组的相关关系更明显（r=1.123，P＜0.01）；且在两组之间sIL-2R浓度均值存在着显著性差异（374.55±84.87，666.32±141.36，P＜0.05）。（2）IL-2干预前后恶性胸腔积液中sIL-2R浓度分别为（563.2±92.61），（390.12±101.12），差异有显著性意义（p＜0.05）；而IL-2干预前后恶性胸腔积液中TIL表面IL-2Rα链的表达分别为（12.54±3.73％）、（13.37±2.65％），差异无显著性意义（p＞0.05）。CD8+％分别为（29.3±7.9％，）、（28.7±6.3％），差异无显著性意义（p＞0.05）。IL-2干预后高浓度组与低浓度组的TIL CD8+％分别为（31.34±9.8）％、（59.65±11.0）％，差异有极显著性意义（p＜0.001）。结论：外源性IL-2能够有效地刺激TIL的增殖，恶性胸腔积液中sIL-2R浓度的不同能够影响外源性IL-2干预后CD8+TIL的比例，高浓度的sIL-2R恶性胸腔积液患者对外源性IL-2刺激引起的CD8+细胞增殖低于低浓度患者；可能与TIL表面表达IL-2Rα链对外源性IL-2的刺激不敏感有关系。全文小结在第一部分中应用流式细胞仪技术检测肺癌患者外周血及肺癌组织局部CD4+CD25+调节性T细胞的分布，发现肺癌患者全身或局部均有调节性T细胞比例增高，且与分期有关。提示肺癌患者体内存在免疫异常；接着对肺癌组织中FOXP3的表达检测，提示肺癌组织局部有CD4+CD25+调节性T细胞的浸润，且较良性病变表达增高；在第三部分中探讨在与肺癌细胞直接接触与非直接接触环境下，TGF-β1在肺癌患者CD4+CD25+调节性T细胞比例增高中可能发挥的机制。提示TGF-β1在与肺癌组织直接接触的环境中能调节FOXP3表达增加，即上调CD4+CD25+调节性T细胞的比例，从而在肺癌免疫逃逸机制中发挥一定的作用，细胞直接接触可能是肿瘤局部免疫抑制的主要机制。第四部分检测肺癌患者恶性胸腔积液sIL-2R浓度及TIL表面IL-2Rα链（CD25）的表达，观察给予外源性IL-2后恶性胸腔积液TIL表面IL-2Rα的表达变化，同时检测CD8+TIL的比例，结果提示外源性IL-2能够有效地刺激TIL的增殖，恶性胸腔积液中sIL-2R浓度的不同能够影响外源性IL-2干预后CD8+TIL的比例，可能与TIL表面表达IL-2Rα链对外源性IL-2的刺激不敏感有关系。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
正文 CD4~+CD25~+调节性T细胞在肺癌免疫逃逸机制中的作用初探
第一部分 肺癌患者CD4~+CD25~+调节性T细胞的检测及意义
前言
材料与方法
结果
讨论
参考文献
第二部分 FOXP3在肺癌组织中的表达及相关意义探讨
前言
材料与方法
结果
讨论
参考文献
第三部分 TGF-β1参与肺癌CD4~+CD25~+调节性T细胞比例增高的机制初探
前言
材料与方法
结果
讨论
参考文献
第四部分 外源性IL-2对恶性胸腔积液中肿瘤浸润淋巴细胞增殖的机制研究
前言
材料与方法
结果
讨论
参考文献
综述 CD_4~+CD_(25)~+调节性T细胞与肿瘤免疫
致谢
发布时间: 2007-07-13
参考文献
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