基于核酸的电化学技术研究

论文摘要

本文中,我们基于功能核酸成功地构建了两个电化学DNA传感器来分别检测小分子药物博来霉素和特定的靶标DNA序列。博来霉素虽然广泛应用于多种癌症的治疗中,但它在临床使用中会出现一些毒副作用如容易导致肺纤维化等。为了使博来霉素作为抗癌药物发挥出最大的作用,同时将它的毒副作用降至最低,我们提出了一种简单、快速、方便的电化学方法来检测博来霉素。实验选用一段已报导研究的DNA作为博来霉素的底物,这段DNA的一端固定到金电极表面制成一个电化学DNA传感器,另一端标记电化学指示剂二茂铁。当检测体系中加入博来霉素与Fe2+形成的Fe（Ⅱ）-BLMs后,这个复合物会断裂电极表面的DNA。实验结果表明,我们设计的这个传感器检测博来霉素的最低检测限达到100 pM （0.293 ng/mL）,而且这个传感器即使在血清这样的复杂环境中对100pM的博来霉素也有很好的信号响应。核酸外切酶Ⅲ可以特异性地识别出双链DNA结构,并沿3’-5’方向逐步地消化单核苷酸,利用这一特性我们设计了一个在核酸外切酶Ⅲ协助下循环检测特定靶标DNA的电化学DNA的传感器,选用[Ru（NH3）6]3+作为电化学指示剂。实验中核酸外切酶Ⅲ只会大量消化固定在电极表面的探针DNA,不会消化加入的靶标DNA,其最低检测限为20 fM。同时,我们比较了在不同位点有不同数量碱基错配的情况,实验结果表明,可以通过该检测体系有效的区分开有不同错配情况的靶标序列,并且当形成的双链DNA的3’端有连续四个以上碱基发生错配时核酸外切酶Ⅲ将不再消化DNA,反应终止。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 电化学概论
• 1.1.1 电化学的发展简史
• 1.1.2 电化学的研究内容
• 1.1.3 电化学检测的基本装置
• 1.1.4 电化学的检测方法
• 1.1.5 电化学反应的指示剂
• 1.1.6 电化学的应用
• 1.2 功能核酸传感器
• 1.2.1 基于酶的核酸传感器
• 1.2.2 核酸适体（Aptamer）传感器
• 1.2.3 电化学DNA传感器
• 1.3 实验目的及意义
• 第2章 基于DNA用电化学方法检测微量博来霉素
• 2.1 引言
• 2.1.1 博来霉素治疗癌症的机理
• 2.1.2 检测博来霉素的目的及意义
• 2.2 实验原理
• 2.3 实验材料与仪器
• 2.3.1 实验材料与试剂
• 2.3.2 实验仪器
• 2.4 实验步骤
• 2.4.1 琼脂糖凝胶电泳验证博来霉素活性
• 2.4.2 表征工作电极
• 2.4.3 在金电极表面固定巯基DNA探针及钝化金电极
• 2.4.4 优化检测液
• 2.4.5 考察金电极的工作性能
• 2.4.6 计算金电极表面固定的探针密度
• 2.4.7 确定博来霉素的检测限
• 2.4.8 实时在线检测
• 2.4.9 不同金属离子特异性比较
• 2.4.10 实际样本血清中检测
• 2.4.11 交流阻抗验证博来霉素切断DNA的过程
• 2.5 实验结果与讨论
• 2.5.1 琼脂糖凝胶电泳验证博来霉素活性
• 2.5.2 表征工作电极
• 2.5.3 SWV检测液的优化
• 2.5.4 考察金电极的工作性能
• 2.5.5 计算金电极表面固定的探针密度
• 2.5.6 电化学方法验证博来霉素切断DNA的过程
• 2.5.7 博来霉素检测限
• 2.5.8 博来霉素实时在线检测
• 2.5.9 不同金属离子特异性比较
• 2.5.10 实际样本血清中检测
• 2.5.11 交流阻抗验证博来霉素切断DNA的过程
• 2.6 小结
• 第3章 利用核酸外切酶Ⅲ检测特定的DNA序列
• 3.1 引言
• 3.2 实验原理
• 3.3 实验材料与仪器
• 3.3.1 实验材料和试剂
• 3.3.2 实验仪器
• 3.4 实验步骤
• 3.4.1 构建E-DNA传感器
• 3.4.2 优化杂交效率
• 3.4.3 确定靶标序列T1的检测限
• 3.4.4 双链DNA的3'末端突出长度对核酸外切酶Ⅲ活性的影响
• 3.4.5 酶切反应时间动力学曲线
• 3.4.6 实际样本血清中验证E-DNA传感器的稳定性（检测靶标T1）
• 3.5 实验结果与讨论
• 3.5.1 优化杂交效率
• 3.5.2 E-DNA传感器的可行性研究
• 3.5.3 靶标DNA的检测限
• 3.5.4 在血清中检测靶标DNA
• 3.5.5 双链DNA的3'末端突出的长度对核酸外切酶Ⅲ活性的影响
• 3.5.6 E-DNA传感器的选择性
• 3.6 小结
• 第4章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢