酿造酱油米曲霉淀粉酶分离纯化及性质研究

论文摘要

本研究利用两种方法分离纯化出淀粉酶单组分Amylase-2,探究了它的酶学性质,为研究酱油成曲中淀粉酶组分及活力对酱油产量和品质的影响提供理论基础。优化了检测米曲霉淀粉酶的Starch-PAGE条件。分离胶中底物淀粉溶液浓度达3.0%,孵育时间为3h时能较为清晰地显示淀粉酶单组分。在同一底物浓度下,淀粉酶上样量不同,电泳条带上显示出的淀粉酶单组分不同。采用该法初步鉴定出米曲霉种曲和成曲浸提液都有四个淀粉酶单组分。按迁移率由小到大的顺序命名为Amylase-1、Amylase-2、Amylase-3和Amylase-4。其中Amylase-2组分的活性最强。通过制备电泳纯化出成曲淀粉酶组分中活性最强的组分Amylase-2,经SDS-PAGE电泳检测基本达电泳纯,相对分子质量为52.0kD。另外,成曲浸提液经硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose-52离子交换柱层析、Sephadex-G-100凝胶过滤层析获得单一的电泳条带,该组分相对分子量为52.0kD,与Amylase-2一致。通过纯化,淀粉酶的纯度提高了11. 35倍,收得率为7.76%。酶学性质分析表明:纯化的Amylase-2最适温度50℃,并且在40℃保持较长时间稳定,热耐受性较低。该酶的最适反应pH为6.2,在中性偏酸范围该酶具有较好的稳定性。动力学研究表明,40℃时Amylase-2分解可溶性淀粉溶液的动力学常数Km和Vmax分别为0.149mg/mL和6.14mg/min。Mn2+强烈激活酶活性,K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+对酶活有一定的激活作用, Na+、Fe2+基本不影响酶活性,但Ba2+、Pb+、Cu2+等金属离子不同程度抑制酶活性,其中Hg2+强烈抑制酶活性。该酶对红薯、小麦淀粉及熟淀粉分解能力较强。薄层层析法分析酶解产物,纯化的Amylase-2属于α-淀粉酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第1章 综述
• 1.1 米曲霉简介
• 1.2 淀粉酶简介
• 1.2.1 淀粉酶概述
• 1.2.2 淀粉酶的种类及作用机理
• 1.2.3 淀粉酶活力测定
• 1.2.4 淀粉酶的分子生物学
• 1.2.5 淀粉酶的用途
• 1.3 酱油生产及主要酶的作用
• 1.3.1 酱油的生产工艺
• 1.3.2 酱油生产中米曲霉酶系的作用
• 1.3.3 淀粉酶与酱油品质
• 1.4 本论文的主要研究内容及意义
• 第2章 酿造酱油种曲与成曲浸提液比较
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.2 试剂
• 2.3 仪器
• 2.4 方法
• 2.4.1 种曲制备
• 2.4.2 成曲制备
• 2.4.3 种曲和成曲粗酶液浸提
• 2.4.4 浸提液蛋白质浓度测定
• 2.4.5 浸提液淀粉酶活力的测定
• 2.4.6 浸提液聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.7 浸提液淀粉酶活性组分的鉴定
• 2.5 实验结果与分析
• 2.5.1 蛋白质标准曲线
• 2.5.2 麦芽糖标准曲线
• 2.5.3 浸提液性质
• 2.5.4 浸提液的PAGE 图谱
• 2.5.5 浸提液的Starch-PAGE 图谱
• 2.6 小结
• 第3章 活性电泳条件的优化
• 3.1 材料
• 3.2 试剂
• 3.3 仪器
• 3.4 方法
• 3.4.1 Starch-PAGE 电泳显示淀粉酶活性组分
• 3.4.2 淀粉平板法检测淀粉酶组分
• 3.5 实验结果及分析
• 3.5.1 底物浓度对检测灵敏度的影响
• 3.5.2 上样量对检测灵敏度的影响
• 3.5.3 孵育时间对检测灵敏度的影响
• 3.5.4 两种检测淀粉酶活性组分方法比较
• 3.6 小结
• 第4章 制备电泳回收酱油成曲淀粉酶单组分
• 4.1 材料
• 4.2 试剂
• 4.3 仪器
• 4.4 方法
• 4.4.1 成曲浸提液蛋白质浓度的测定
• 4.4.2 成曲浸提液淀粉酶活力的测定
• 4.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测成曲浸提液天然蛋白
• 4.4.4 Starch-PAGE 电泳检测浸提液淀粉酶活性组分
• 4.4.5 SDS-Starch-PAGE 电泳检测成曲淀粉酶各组分分子量
• 4.4.6 淀粉平板法检测淀粉酶组分
• 4.4.7 制备电泳回收目的组分
• 4.5 实验结果与分析
• 4.5.1 底物淀粉溶液对蛋白质条带迁移率的影响
• 4.5.2 SDS-Starch-PAGE 检测各组分分子量
• 4.5.3 淀粉平板显示目的组分
• 4.5.4 PAGE 检测纯化的目的组分
• 4.5.5 Starch-PAGE 检测纯化的目的组分
• 4.5.6 Amylase-2 纯度及分子量
• 4.6 讨论
• 4.7 小结
• 第5章 酱油成曲淀粉酶单组分的分离纯化
• 5.1 材料
• 5.2 试剂
• 5.3 仪器
• 5.4 方法
• 5.4.1 种曲制备
• 5.4.2 成曲制备
• 5.4.3 成曲粗酶液的浸提
• 5.4.4 硫酸铵分级沉淀
• 5.4.5 DEAE-Cellulose-52 分离酱油成曲淀粉酶单组分
• 5.4.6 Sephadex-G-100 凝胶过滤分子筛层析
• 5.4.7 SDS-PAGE 法检测纯化淀粉酶的纯度
• 5.5 实验结果
• 5.5.1 硫酸铵饱和度确定
• 5.5.2 DEAE-Cellulose-52 离子交换柱层析
• 5.5.3 Sephadex-G-100 凝胶过滤分子筛层析
• 5.5.4 检测纯化组分的纯度及分子量
• 5.5.5 淀粉酶单组分的分离纯化结果
• 5.6 小结
• 第6章 酶学性质研究
• 6.1 材料
• 6.2 试剂
• 6.3 仪器
• 6.4 方法
• 6.4.1 Amylase-2 酶解最适温度与热稳定性
• 6.4.2 Amylase-2 酶解最适pH 和pH 稳定性
• 6.4.3 金属离子依赖性
• 6.4.4 米氏常数测定
• 6.4.5 酶的最适底物研究
• 6.4.6 薄层层析法分析酶解产物
• 6.5 结果与分析
• 6.5.1 Amylase-2 最适温度与温度稳定性
• 6.5.2 Amylase-2 最适pH 值和pH 稳定性
• 6.5.3 金属离子对Amylase-2 活力的影响
• 6.5.4 米氏常数的测定
• 6.5.5 酶的最适底物
• 6.5.6 酶解产物的薄层层析分析
• 6.6 小结
• 第7章 结论
• 参考文献
• 致谢