利用功能分子标记分析甘蓝型油菜产量相关性状QTLs及其杂种优势遗传基础

论文摘要

油菜是我国主要的油料作物，提高油菜籽产量和含油量以增加单位面积产油量是当前油菜研究和育种的首要目标。杂种优势利用是提高作物产量不可替代的最重要的途径，在油菜育种中已被广泛应用。与杂种优势利用取得的辉煌成绩相比，杂种优势机理的研究却远远滞后。已有研究表明，杂种和双亲间的差异表达基因与杂种优势的形成关系密切。但是，这些大量差异表达的基因是否与杂种优势或产量相关性状有关，目前尚不清楚。因此，将差异基因发展为功能标记并整合到图谱中，同时对重要农艺性状进行QTLs定位，从而确定差异表达基因与QTLs之间的关系，将在一定程度上有助于探讨杂种优势的遗传机理，促进甘蓝型油菜产量相关性状QTLs的克隆和利用。此外，模式植物拟南芥和水稻各个方面的研究都比较先进，甘蓝型油菜与模式植物的比较分析将有助于加快油菜上述各项研究的进程。本研究以SI-1300和Eagle组配得到的F2分离群体为基础，利用杂种和亲本的差异表达基因作标记构建的图谱为依托，对单株产量、单株角果总数等12个产量相关性状进行了QTLs定位和上位性分析，探讨了甘蓝型油菜杂种优势的机理，并利用本研究在甘蓝型油菜成功定位的功能分子标记开展了和其它作物的比较基因组学研究。主要结果如下：1．根据杂种和亲本间的差异表达基因共设计了261对能扩增不同基因的引物对，其中247对引物序列在双亲SI-1300和Eagle中能扩增出清晰、明亮的条带。经过SSCP分析，111对引物的PCR扩增产物在双亲间能检测到清晰的多态性，共得到了177个功能分子标记。2．根据Gene Ontology网站提供的分类信息，对能在双亲间扩增得到多态性的111个基因进行了分类。这些基因涉及了该分类标准的所有类别，共包括17大类，以初级代谢的基因最多。3．以180个SSR标记、191个AFLP标记、152个SRAP标记和177个功能分子标记进行连锁遗传分析。在LOD≥3.0的条件下，共有582个标记进入连锁群，得到一张包含20个连锁群的甘蓝型油菜分子遗传图谱。该图谱总长2054.51 cM，标记间平均图距为3.53 cM。综合利用Piquemal等（2006）、Lowe等（2005）以及BBSRC网站等提供的油菜图谱中SSR标记的信息，对本研究中构建的油菜图谱与国际公认的图谱进行了初步比较。比较结果表明，该图谱中的19条连锁群可与公认的图谱（N1-N19）对应，仅是多出了1条连锁群（LG 20）。4．12个产量相关性状均表现为正态分布。产量相关各性状在家系间的表型差异达到极显著水平，变异非常丰富。遗传力的变异范围为0.41～0.81。不同地点相同性状之间（除单株角果总数外）均存在极显著正相关性；同一地点不同性状之间的相关性也很明显。5．利用复合区间作图法，在武汉和荆门两点共检测到影响12个性状的133个QTLs（LOD≥12.5），其中有14个QTLs在两个地点都能被检测到。每个性状可以检测到7～15个QTLs不等。单个QTL可以解释的变异在3.02％～36.68％之间，平均为11.62％。涉及39个不同ESTs或基因的45个功能分子标记和产量及其相关性状有关，并且基础代谢的基因最多。6．QTLs在连锁群上的分布并不是随机的，而成聚集分布，主要分布在N2和N7连锁群上；一些不同性状的QTLs定位在相同的区域，即存在一因多效或紧密连锁；高值亲本和低值亲本都包含对性状表现起增效作用（或减效作用）的等位基因；产量及其相关性状QTLs区域的相关位点表现了显性和超显性现象。7．基因杂合性与性状值之间的相关系数表明，全基因组杂合性和性状之间并不存在显著相关。8．利用169个共显性标记，对12个产量相关性状检测了全基因组所有可能的两位点互作对。取P＜0.01，12个性状在武汉和荆门两点分别检测到1093对和1121对极显著互作位点。经随机测验后，在武汉和荆门两点分别有297对和285对符合要求的位点对，共同的有6对。结果显示，油菜基因组中控制产量相关性状的互作位点数显著高于单一位点数。9．本研究检测到的位点间互作有QTLs与非QTLs位点的互作和非QTLs位点与非QTLs位点间的互作，且后者类型占据了绝大多数。大多数位点的单独效应值一般都较小，但当两位点发生互作时，其效应值显著增大，成为显著影响性状表现的互作位点对；同一个位点可以与不同的位点互作，从而对同一性状产生影响，但效应值存在差异；相同的位点互作对可能影响不同的性状，即存在上位性互作的多效性。10．单位点水平上的显性效应、超显性效应以及位点间的上位性互作效应都是甘蓝型油菜产量性状杂种优势的重要来源。11．随机挑选10个功能标记的扩增产物测序。测序结果与原始序列比较分析发现，二者之间的相似程度极高，平均达到98％，最小的也有96％。说明扩增引物对原始序列进行了真实的扩增；随机挑选5对引物在双亲间的扩增差异片断进行回收、克隆并测序。对双亲间测序结果的比较发现，功能基因在双亲间的序列差异比较小。12．利用TAIR网站的seqview软件，对整合到甘蓝型油菜遗传图谱的107个功能基因在拟南芥中的同源基因进行了电子定位。这些基因在拟南芥5条染色体上均有分布，共覆盖拟南芥基因组的110.95 MB。通过甘蓝型油菜和拟南芥之间的比较作图，本研究中共得到了21个共线性区域，涉及了油菜标记60个和拟南芥基因50个，这些共线性区域存在于甘蓝型油菜的15条连锁群上，并发现在拟南芥基因组上的每个共线性区域在油菜中存在1-7个拷贝。13．在NCBI中利用Blastx查询水稻、玉米和小麦中位于油菜QTLs区间内功能标记序列的相似序列，大多数序列都能找到同源基因。在水稻中，对上述同源基因进行电子定位，并查找附近区域产量性状相关的QTLs，结果在部分水稻同源序列附近发现有与控制油菜类似性状相关的QTLs。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1. 文献综述
• 1.1 分子标记
• 1.1.1 SSR标记
• 1.1.2 SRAP标记
• 1.1.2.1 种质资源的鉴定评价
• 1.1.2.2 遗传图谱构建
• 1.1.2.3 重要性状基因定位和基因克隆
• 1.1.3 AFLP标记
• 1.1.4 SSCP标记
• 1.1.4.1 SSCP技术的基本原理及影响因素
• 1.1.4.2 SSCP技术的应用
• 1.2 油菜的遗传图谱及其数量性状研究
• 1.2.1 油菜的遗传图谱
• 1.2.2 QTLs主要作图方法
• 1.2.2.1 单一标记分析法
• 1.2.2.2 区间作图法（Interval Mapping，IM）
• 1.2.2.3 复合区间作图法（Composite Interval Mapping，CIM）
• 1.2.2.4 基于混合线性模型的复合区间作图法（Mixed Composite Interval Mapping，MCIM）
• 1.2.3 QTLs精细定位
• 1.2.4 甘蓝型油菜重要性状的分子标记和QTLs定位研究
• 1.2.4.1 抗病相关性状的研究
• 1.2.4.2 品质相关性状的研究
• 1.2.4.3 育性相关性状的研究
• 1.2.4.4 发育相关性状的研究
• 1.2.4.5 产量相关性状的研究
• 1.2.4.6 其它性状的研究
• 1.3 植物杂种优势及其机理研究
• 1.3.1 杂种优势的分类
• 1.3.2 杂种优势的表现
• 1.3.3 杂种优势的遗传学基础
• 1.3.3.1 杂种优势的经典理论
• 1.3.3.2 现代分子生物学技术对杂种优势的解析
• 1.3.3.3 杂种优势的其他理论
• 1.4 芸薹属植物比较基因组学研究
• 1.4.1 芸薹属植物基因组概况
• 1.4.2 芸薹属植物比较遗传图谱研究
• 1.4.2.1 芸薹属植物之间的比较作图
• 1.4.2.2 芸薹属植物与拟南芥之间的比较遗传作图
• 1.4.3 芸薹属植物微观共线性研究
• 1.4.3.1 芸薹属植物比较物理作图
• 1.4.3.2 序列水平的比较研究
• 2 本研究的目的、意义及研究内容
• 3 材料和方法
• 3.1 实验材料、田间试验及性状考察
• 3.2 DNA提取
• 3.3 SSR分析
• 3.4 SRAP分析
• 3.5 功能分子标记分析—SSCP法
• 3.5.1 功能分子标记来源
• 3.5.2 引物设计
• 3.5.3 PCR反应体系，反应程序及多态性检测
• 3.6 基因型记载
• 3.7 片断回收，克隆及测序
• 3.7.1 片段的回收及再扩增
• 3.7.2 连接反应
• 3.7.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 3.7.4 重组子筛选、鉴定
• 3.7.5 克隆片段的测序及其序列分析
• 3.8 数据分析
• 3.8.1 农艺性状
• 3.8.2 等位基因的分离频率检测
• 3.8.3 分子标记连锁图构建及相似序列查找
• 3.8.4 标记均匀分布计算
• 3.8.5 QTLs定位及QTLs的命名
• 3.8.6 上位性检测
• 4. 结果与分析
• 4.1 甘蓝型油菜功能分子图谱构建
• 4.1.1 功能分子标记
• 4.1.1.1 功能基因的引物设计
• 4.1.1.2 功能基因的多态性检测
• 4.1.1.3 功能基因的功能分类
• 4.1.2 SRAP分析
• 4.1.3 SSR分析
• 4.1.4 偏分离标记检验
• 4.1.5 遗传图谱构建
• 4.1.6 标记在图谱上的分布
• 4.2 产量相关性状QTLs分析
• 4.2.1 产量及其相关性状的表型表现及其相关性分析
• 4.2.2 产量相关性状QTLs定位分析
• 4.2.2.1 QTLs定位结果
• 4.2.2.2 与产量相关性状有关的功能分子标记
• 4.3 重要产量相关性状杂种优势分析
• 4.3.1 QTLs的显性、超显性检测
• 4.3.2 基因杂合性和性状表现的关系
• 4.3.3 上位性检测
• 4.4 基于功能分子标记的比较基因组学研究
• 4.4.1 功能分子标记的测序分析
• 4.4.2 甘蓝型油菜图谱与拟南芥基因组的比较分析
• 4.4.2.1 功能基因在拟南芥图谱上的分布
• 4.4.2.2 比较作图
• 4.4.3 位于甘蓝型油菜QTLs区间的功能分子标记与水稻、小麦、玉米的比较分析
• 4.4.3.1 与水稻、小麦、玉米的序列比较
• 4.4.3.1 水稻同源序列的电子定位及其附近产量相关性状的查找
• 5 讨论
• 5.1 SSCP技术的优越性
• 5.2 甘蓝型油菜功能分子图谱
• 5.2.1 图谱质量
• 5.2.2 偏分离现象
• 5.2.3 功能图谱
• 5.3 QTLs定位
• 5.3.1 QTLs定位的准确性
• 5.3.2 甘蓝型油菜产量相关性状的QTLs
• 5.3.3 QTLs与功能分子标记之间的关系
• 5.4 甘蓝型油菜杂种优势的遗传基础
• 5.5 比较作图
• 5.5.1 比较基因组学在QTLs定位研究中的作用
• 5.5.2 甘蓝型油菜和拟南芥之间的比较作图
• 参考文献
• 致谢
• 研究生阶段发表的文章