论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种慢性神经系统退行性疾病，其病理特征为黑质致密部（substania nigta pars compacta，SNC）多巴胺能神经元（dopaminergic neuron，DA）变性、凋亡。临床上表现为静止性震颤、肌肉僵直、运动弛缓等一系列症状。最近的研究认为DA能神经元的损伤与机体氧化应激有关。抗氧化治疗是目前公认确实有效的治疗PD的方案之一。近年来，针刺在改善PD症状方面有显著的疗效，能够在一定程度上延缓病情进展、减低西药的副作用，针刺治疗的安全性和耐受性也得到了初步肯定。但由于各方面原因，在针刺治疗PD的作用机制方面研究还不够深入，进一步从氧化应激角度揭示针刺防治PD的作用机制，将为临床针刺治疗PD提供可靠的实验依据。本实验分为四部分：（1）观察PD小鼠行为学改变、黑质酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）阳性神经元的丢失以及电针的干预作用；（2）应用免疫组化技术观察黑质部位PD小鼠脑内钙结合蛋白D28k（Calbindin—D28k）的表达以及电针的影响；（3）应用组织化学和免疫组化技术观察黑质和纹状体部位PD小鼠脑内铁和铁蛋白表达以及电针的影响；（4）应用免疫组化技术观察黑质和纹状体部位PD小鼠脑内神经元型一氧化氮合酶（neuron nitric oxide synthase，nNOS）的表达以及电针的影响。选用C57BL／6小鼠，应用0.33％MPTP（生理盐水配制）按30mg／kg／d腹腔注射，连续5天，建立PD动物模型。动物随机分为三组：（1）正常组；（2）模型组；（3）电针组。动物的存活期分别是一周、两周和四周。主要实验结果如下：（1）电针对PD小鼠行为学以及黑质致密部TH阳性神经元丢失的影响在注射MPTP后各组小鼠均出现不同程度的行为障碍和自发性活动减少，模型组小鼠爬杆时间明显延长，爬杆时间差增加，与正常组比较，差异极显著（P＜0.01），四周后与正常组差异不显著；电针组小鼠的爬杆时间差均比模型组减少，其中以二周后的差别最为明显，与模型组比较，差异显著（P＜0.05）。正常组小鼠在SNC部位和腹侧被盖区（ventrall tegmental area，VTA）部位可见许多TH阳性神经元和纤维，模型组上述部位内TH阳性神经元减少非常明显，残存的神经元也多为弱阳性，以SNC部位减少最明显，IOD值与正常组相比显著极差异（P＜0.001）；电针组SNC部位的TH阳性神经元的数量和染色程度与模型组相比有显著增加，IOD值与模型组差异显著（P＜0.001）。其中以电针四周效果最好，差异最显著。（2）电针对PD小鼠中脑黑质Calbindin-D28k表达的影响正常组小鼠在黑质致密部可见数个散在分布的Calbindin-D28k免疫阳性细胞，在VTA部位可见数量较多、分布密集的Calbindin-D28k免疫阳性细胞，网状部可见Calbindin-D28k免疫阳性纤维。模型组Calbindin-D28k免疫阳性细胞数量少，染色浅，IOD值与正常组差异极显著（P＜0.001）。其中以模型四周组差异最大。电针组阳性细胞和纤维的数量增多，染色加深。IOD值与模型组差异显著（P＜0.05），以电针两周效果最好。（3）电针对PD小鼠脑内铁和铁蛋白含量的影响正常组铁反应阳性细胞，体积较小，主要分布在黑质，数量较少。模型组黑质部位铁阳性细胞的数量增多，光密度增强，IOD值与正常组比较差异极显著（P＜0.01）。电针组黑质阳性细胞数量和染色程度与正常组相似，与正常组相比差异不显著；其中电针一周和电针四周与模型组相比差异极显著（P＜0.001），电针两周与模型组差异显著（P＜0.05）。正常组铁蛋白免疫阳性细胞呈棕黄色，其分布、体积与铁基本一致。模型组黑质部位的阳性细胞的密度和染色程度与正常组相比都有下降，与正常组相比差异极显著（P＜0.01）。其中模型两周组下降最为明显；纹状体的阳性细胞密度和染色程度与正常组相比也都有明显的下降，IOD值与正常组相比差异极显著（P＜0.01）。电针组黑质和纹状体部位的阳性细胞密度和染色程度比模型组增加，IOD值与模型组相比差异极显著（P＜0.01）。以电针两周组增加最明显。（4）电针对PD小鼠脑神经元型一氧化氮合酶的影响正常组小鼠脑内黑质部位nNOS阳性细胞主要分布在SNC，其排列分布方式与TH阳性神经元的极为相似，模型组与正常组相比，IOD值显著升高，差异极显著（P＜0.01），其中以模型四周组升高最多。电针组小鼠nNOS阳性细胞的形态及染色程度已接近正常组，IOD值与模型组相比降低且差异极显著（P＜0.001），与正常组相比差异不显著。正常组小鼠纹状体部位的nNOS免疫阳性神经元分布疏散，nNOS阳性颗粒主要在胞浆表达，胞核不表达。模型组nNOS免疫阳性神经元数目增多，染色程度增强，IOD值与正常组相比差异极显著（P＜0.01）。电针组nNOS免疫阳性神经元分布较模型组少，IOD值与与模型组差异极显著（P＜0.01），与正常组相比差异不显著，电针四周组下降最明显。结论：由以上结果推断出：MPTP制造的PD小鼠模型脑内存在氧化应激现象。电针可能通过提高小鼠脑内铁蛋白的表达，降低nNOS和铁的表达，从而提高小鼠脑抗氧化能力，降低自由基对DA能神经元的损伤，达到改善PD小鼠行为异常和保护黑质多巴胺神经元的目的。电针也可能通过提高黑质Calbindin-D28k表达，使钙结合蛋白与黑质细胞内游离钙离子结合，减轻细胞内钙超载，从而对DA能神经元起到保护作用。本实验通过对PD小鼠脑内氧化应激相关因子的研究，进一步证实了氧化应激是PD发病的重要机制之一。并发现电针能够提高PD小鼠脑抗氧化能力，降低自由基对脑的损伤，从而达到防治PD的作用，为临床电针治疗PD提供了重要的依据。