霍山蹦蝗和意大利蝗全线粒体基因组的测序及分析

论文摘要

线粒体DNA自上世纪70年代以来被广泛用于研究群体遗传结构，谱系地理学（phylogeography）和各种分类学水平上的系统发育关系研究。DNA测序技术的发展使得测定大量分类单元线粒体全基因组的工作成为现实，目前已测定全线粒体基因组序列的后生动物有745种，其中昆虫纲49种，但直翅目昆虫只有非洲飞蝗（Locusta migratoria）和东方蝼蛄（Gryllotalpa orientalis）被测序。因此为了更加清楚的研究昆虫线粒体基因组的差异及进化，急需对更多的直翅目昆虫全线粒体基因组序列进行测序和分析。 为了探索直翅目斑腿蝗科昆虫线粒体基因组的进化特征，本研究采用基于长PCR的二次PCR策略，结合克隆测序方法，对直翅目斑腿蝗科的两种代表昆虫霍山蹦蝗（Sinopodisma houshana）和意大利蝗（Calliptamus italicus）全线粒体基因组进行测序和组装。分析了它们线粒体基因组的基因和蛋白质组成、同义密码子差异、tRNA和rRNA结构等多层次信息，并联合GenBank收录的六足总纲全线粒体基因组数据对系统发育关系进行重建。得到以下主要结论： 1．采用了基于长PCR技术的二次PCR测序策略，解决了昆虫肌肉组织线粒体纯化的困难，并避免了假基因的干扰。通过结合克隆测序方法，降低了实验难度，提高了该策略的通用性和稳定性，从而建立起一套快速、精确地进行昆虫全线粒体基因组测序的实验体系。 2．设计出了一套直翅目昆虫全线粒体基因组扩增的通用引物，并成功地应用到2种蝗虫的线粒体基因组测序中。 3．霍山蹦蝗和意大利蝗线粒体全基因组长度分别为15 818 bp和15 667 bp，存在很强的碱基AT组成偏向性。2个线粒体基因组均包含13种蛋白质基因、22种tRNA基因和2种rRNA基因，srRNA与tRNAIle基因间存在AT富含区。 4．两种蝗虫线粒体在基因顺序上与飞蝗相同，tRNAAsp（D）和tRNALys（K）基因顺序与包括蝼蛄在内的多数昆虫线粒体基因顺序存在倒置，而与蜜蜂相同。这种现象暗示相同的基因重排现象不一定具有同源性。 5．两种蝗虫线粒体蛋白质基因都使用了ATN作为起始密码子，而COI基因均使用了正常的ATC三联起始密码子，未出现飞蝗以ATTA作为起始密码子的情况。两种蝗虫除分别存在3个和2个不完整的TA或T外，都以TAA或TAG作为终止密码子。

论文目录

• 第一部分 前言
• 1 基因组与线粒体基因组学研究概况
• 1.1 基因组学研究概况
• 1.1.1 人类基因组计划与模式生物基因组计划
• 1.1.2 结构与功能基因组学
• 1.1.3 比较及进化基因组学
• 1.1.4 基因组测序方法
• 1.2 线粒体基因组学研究概况
• 1.2.1 线粒体基因组学研究内容
• 1.2.2 节肢动物全线粒体基因组测序现状
• 1.2.3 线粒体RNA二级结构变化
• 1.3 基因组与线粒体基因组研究价值
• 1.3.1 基因组学研究意义
• 1.3.2 线粒体基因组学研究意义
• 2 线粒体基因组研究技术和方法
• 2.1 线粒体基因组测序策略比较
• 2.1.1 密度梯度离心分离策略
• 2.1.2 基于长PCR策略及优点
• 2.1.3 基于长PCR策略的类型
• 2.2 线粒体基因组序列分析方法
• 2.3 利用全线粒体基因组联合数据进行系统发育分析
• 3 直翅目昆虫的分类学地位及其全线粒体基因组研究现状
• 3.1 分类学研究概况
• 3.1.1 节肢动物门简介
• 3.1.2 六足总纲简介
• 3.1.3 昆虫纲简介
• 3.2 直翅目、蝗亚目、蝗总科分类学关系
• 3.2.1 斑腿蝗科
• 3.2.2 直翅目及斑腿蝗科的化石资料
• 3.3 霍山蹦蝗与意大利蝗介绍
• 3.4 蝗虫与人类的关系
• 3.5 直翅目全线粒体基因组研究现状
• 3.6 本论文研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 标本的采集、保存与鉴定
• 1.2 仪器和试剂
• 1.2.1 主要实验仪器
• 1.2.2 主要实验试剂
• 1.2.3 计算机和生物信息学软件
• 1.3 实验方法
• 1.4 总DNA提取及检测
• 1.5 长PCR和二次PCR的引物设计
• 1.6 长PCR扩增及纯化
• 1.7 二次PCR扩增及纯化
• 1.8 二次PCR扩增产物的直接测序和克隆后测序
• 2 测序数据处理和初步分析
• 3 序列的组装与注释
• 3.1 测序结果的片段拼接与组装
• 3.2 mtDNA限制性内切酶酶切图谱分析
• 3.3 线粒体基因组序列的基因定位与注释
• 3.4 tRNA和1rRNA的二级结构的预测
• 3.5 利用全线粒体基因组序列进行系统发育分析
• 3.5.1 外群的选择
• 3.5.2 参考序列下载
• 3.5.3 序列比对和组成分析
• 3.5.4 氨基酸序列各位点间变异速率的估计
• 3.5.5 MP法重建六足类昆虫的系统发育树
• 3.5.6 NJ法重建六足类昆虫的系统发育树
• 3.5.7 ML法重建六足类昆虫的系统发育树
• 第三部分 结果分析与讨论
• 1 线粒体基因组研究方法
• 1.1 基因组总DNA提取
• 1.2 长PCR扩增、纯化
• 1.3 二次PCR扩增
• 1.4 二次PCR产物直接测序或克隆测序
• 1.5 测序策略的讨论
• 1.5.1 基于长PCR技术的二次PCR测序策略的优点
• 1.5.2 实验中的几个关键问题
• 2 序列组装
• 2.1 霍山蹦蝗（Sinopodisma houshana）序列组装结果
• 2.2 意大利蝗（Calliptamus italicus）序列组装结果
• 2.3 霍山蹦蝗和意大利蝗线粒体基因组序列酶切图谱分析
• 3 全线粒体基因组的结构和组成分析
• 3.1 全线粒体基因组的基本情况
• 3.1.1 基因结构和基因顺序
• 3.1.2 基因间重叠现象
• 3.1.3 基因间隔序列
• 3.1.4 碱基组成情况分析
• 3.2 蛋白质基因和密码子组成分析
• 3.2.1 蛋白质的起始与终止密码子使用情况
• 3.2.2 蛋白质基因密码子使用情况
• 3.2.3 蛋白质基因密码子偏向性与线粒体tRNA的对应关系
• 3.2.4 蛋白质基因的碱基组成偏向性
• 3.2.5 氨基酸频率与线粒体tRNA和高频密码子匹配度的关系及机制
• 3.2.6 蛋白质基因的亲水性结构分析
• 3.3 tRNA注释结果及结构预测
• Ser（AGN）异构体的探讨'>3.4 tRNA^Ser（AGN）异构体的探讨
• 3.5 rRNA注释结果及结构预测
• 3.6 AT富含区（A+T-Rich Region）及重复序列
• 3.7 部分六足类全线粒体基因组联合数据的系统发育分析
• 3.7.1 蛋白质的氨基酸序列比对结果和数据集组成分析
• 3.7.2 氨基酸序列取代模型和遗传距离计算
• 3.7.3 MP、NJ、ML法重建的六足总纲系统发育树
• 第四部分 结论
• 参考文献
• 附录：部分测序荧光峰图举例
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文