论文摘要
木素是自然界中含量最为丰富的可再生性芳香化合物,真菌中的白腐菌能够通过非特异性的氧化作用将木素彻底矿化成为CO2和H2O。杂色云芝是一类能够高效降解木材的白腐真菌,可以引起木素、纤维素和半纤维素的同时降解。该菌能够产生大量的胞外漆酶（Laccase）和锰过氧化物酶（manganese peroxidase,MnP）,然而无论是漆酶还是锰过氧化物酶都无法直接降解木素中含量最多（80-90%）的非酚型结构。木素过氧化物酶（lignin peroxidase,LiP）能够降解木素中的非酚型结构,但是许多木素的有效降解菌株并不分泌LiP。漆酶在合适的介体存在的条件下也能够降解非酚型木素,但是迄今为止漆酶的天然介体只有一种被发现,因此在白腐真菌中可能还存在其它的木素氧化降解机制。尽管木腐真菌能够通过产生大量的氧化还原酶和水解酶来降解木质纤维素,但是实验表明,这些酶类无法进入完整无损的木材结构内部。电镜观察的结果则更加证实了在木材降解的起始阶段,大分子的酶蛋白无法穿过完整木材的微孔结构进入细胞壁内,因此木腐真菌在木材降解的初期可能通过一些更小的物质对木素进行破坏。本实验室发现纤维素降解真菌能够产生一种低分子量肽类物质（命名为短纤维形成因子,SFGF）。SFGF能通过氧化还原反应将纤维素降解成为短纤维,使其更容易被纤维素酶水解。从密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）中纯化到的短肽能够络合Fe3+,将Fe3+还原成为Fe2+,并通过Fenton反应产生羟基自由基,产生的羟基自由基可以对纤维素和木素进行非特异性氧化。从黄胞原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）发酵液中也纯化到了一类新的具有酚氧化活力的低分子组分（PC因子）,推测PC因子在氧化还原体系中可能执行电子传递体的功能。尽管木素生物降解的研究已开展40多年,但是木素生物降解的机制仍未获得清楚的揭示,需要更多的工作去证实这些推测。本研究工作与上述工作同属我们实验室这一研究方向的工作内容。本论文通过对25株典型木腐真菌进行研究,证明木腐真菌产生分子量低于5000 Da并具有某些特殊性质的低分子量物质为一普适特性。我们从杂色云芝（Coriolus versicolor）培养基中分离到了一类具有络合Fe3+性质的低分子量有机化合物,对这一物质在Fe3+存在的条件下对酶分离木素（CEL）的作用进行了研究,并进一步做了组建胞外可连续降解木素的氧化还原体系的探索,取得了初步结果。本研究丰富了人们对白腐菌胞外低分子系统在组成、功能等方面的认识,并在检测方法和木素降解研究思路上做了积极的探索,以期能够对木素生物降解中非酶组分的作用机制进行更为深入的认识。本论文的主要研究成果如下:1.木腐真菌产生低分子量物质为—普适特性对25株木腐真菌产生的低分子量物质进行CAS反应、Ferrozine反应、TBA反应和氧化酚类物质活性测定的结果发现,具有络合铁、还原铁、产生羟基自由基和氧化酚类物质活性的低分子量物质是普遍存在的。研究表明,白腐菌在生长过程中,会产生一些低分子量物质。这些低分子量物质有的能产生羟自由基,有的能络合铁,有的能还原三价铁为二价铁,有的还具有类似于酚氧化酶的活性。结果显示:菌种不同,所产此类物质的种类不一样,有的菌产两种,而有的菌则产三种或更多;菌种不同,所产此类物质的活性也不一样。本实验室前期工作有多篇文章报道了真菌产生的低分子多肽对纤维素和木素具有氧化作用,由此作为出发点,证明具有活性的低分子量物质在木腐真菌中广泛存在,对证实其作用具有重要的意义。Fenton反应需要Fe2+的参与,而低分子量物质具有络合Fe3+并将Fe3+还原为Fe2+的能力,这为依赖于Fe2+的OH·氧化机制提供了证据。采用TBA（Thiobarburic acid,硫代巴比妥酸）法对25株典型木腐真菌产生的低分子量物质形成OH·的相对活力进行测定发现,这些真菌在木素降解体系生长得到的培养滤液中,分子量低于5000 Da的组分均具有TBA反应的活性,这表明木腐真菌产生的分子量低于5000 Da并具有Fenton活性的低分子量非酶化合物为一普遍性现象。2.杂色云芝分泌的具有螯合铁离子活性的低分子量物质在木素生物降解中作用机制的研究从杂色云芝（Coriolus versicolor）培养基中分离到一类低分子量物质,该物质具有螯合Fe3+的能力,并能够将Fe3+还原为Fe2+,推测该组分可能是Fenton反应中的一类电子传递体。将此组分与酶分离木素（cellulolytic enzyme lignin,CEL）作用,并用1H-NMR、13C-NMR、离子差光谱及碱性硝基苯氧化等方法对作用后CEL的结构变化进行了表征。实验结果证实了此类能够鳌合Fe3+的低分子量物质对木素的作用主要是破坏非酚型木素结构单元中的β-O-4结构。实验结果表明,这类能够鳌合Fe3+的低分子量物质能够在没有酶分子催化的条件下破坏木素结构单元中的β-O-4结构,并能够在木素大分子上添加酚羟基,从而使漆酶和锰过氧化物酶能够直接进行降解,这一反应可能是缺少木素过氧化物酶的真菌降解木素的作用机制之一。木素的生物降解涉及一系列长程氧化还原反应,许多组分在反应中执行电子传递体的功能,本实验中分离到的活性成分的性质表明它也具有传递电子的能力,因此该物质可能是木素氧化降解体系中的一类电子传递体。对这类低分子量物质作用机制的研究能够加深我们对白腐真菌木素降解中非酶组分作用机制的认识。本部分研究结果已刊出（Science in China,2008,51（3）:214-221;中国科学C辑:生命科学2008,38（2）:173-179）。3.杂色云芝分泌的低分子量物质在天然木质纤维素材料的生物降解中作用机制的研究采用三倍体毛白杨作为研究对象,设计对照,用SEM、AFM、GC-MS等手段检测了低分子量物质与酶协同对木材的作用。低分子量物质与木素降解酶共同作用于木材后,其SEM和AFM图像都显示,木材受到腐蚀的程度明显高于单纯用酶处理后木材腐蚀的程度。实验结果表明,低分子量物质和木素降解酶能够破坏致密的木质纤维结构,形成较小的木纤片段,这些小分子的片段更利于酶进行进一步的降解,这同实验室的前期工作证明SFGF可以促进纤维素的降解结论一致。天然木质纤维材料上形成较大的孔洞后,木素降解酶便可以进入到植物细胞壁的内部,因此可以推测这类低分子量物质在木材降解的初期具有重要的生物学功能。将体系处理后木材的降解产物进行抽提并经GC-MS分析,结果表明,两种反应体系中有不同的化合物被检测出来。经低分子量物质处理后杨木粉降解产物中酸性组分的检出量低于未经低分子量物质处理后杨木粉降解产物中酸性组分的检出量,而经低分子量物质处理后杨木粉降解产物中中性组分和酚类组分的检出量高于未经低分子量物质处理后杨木粉降解产物中中性组分和酚类组分的检出量。4.洁丽香菇产生的具有酚氧化活性的低分子量物质的研究由于褐腐菌的木素分解系统不完善,因此它们可能通过特有的途径对木素进行降解,本实验室的工作已经证实了密黏褶菌产生的低分子肽对纤维素具有氧化修饰作用。本实验选择了一株具有木素降解能力的褐腐菌洁丽香菇,对其产生的分子量低于5000 Da的低分子量化合物的特性进行了研究。研究表明,洁丽香菇所产的低分子量物质在254 nm处有吸收峰;通过CAS试验,发现此物质具有络合铁的能力;此物质氧化2,6-DMP的最适pH值为4.0～4.8,最适温度为70℃。以洁丽香菇所产的低分子量物质的粗品为研究对象,研究了其对愈创木酚、3,5-DMP、2,6-DMP、1,2,4-三甲基苯、1,2,3-三甲基苯、香草醛、紫丁香醛联氮及VA（藜芦醇）等物质的氧化情况。发现低分子量物质对愈创木酚、2,6-DMP、紫丁香醛联氮有氧化作用,对香草醛、1,2,3-三甲基苯及VA无明显作用,而对1,2,4-三甲基苯是否有作用还有待进一步研究。