α-（2，3）/（2，6）唾液酸对肿瘤细胞Cx43间隙连接功能影响的研究

论文摘要

间隙连接通讯（gapjunction intercellular communication，GJIC）是以细胞间的间隙连接（gapjunction，GJ）为途径进行的细胞间直接的信息交流的一种方式，可允许小于1-2kDa的小分子物质如金属离子、第二信使及其它小分子代谢产物通过，使细胞间可以不通过细胞外空间而达到直接通讯的目的。GJIC与肿瘤密切相关，多数肿瘤细胞表现为GJIC能力降低或丧失，这是肿瘤细胞内间隙连接异常，导致间隙连接功能障碍所致。间隙连接异常主要表现为连接蛋白（Cx）的异常，其分子机制可能有以下4个方面：（1）Cx基因突变；（2）Cx mRNA表达降低或异常表达；（3）Cx蛋白分布异常（分布在细胞质内而不是细胞膜上）；（4）其它蛋白对Cx功能的异常调节。由于间隙连接减少，GJIC水平降低，肿瘤细胞内生长刺激信号超过阀值或生长抑制信号达不到阀值，因此肿瘤细胞表现为过度增生和恶性表型。细胞膜表面的糖链有三种存在形式，即支链中性糖苷、酸性直链蛋白聚糖及糖脂，这些糖缀合物通过糖基化影响蛋白质功能，在细胞表面形成分支状的糖链宛如“天线”，传递着细胞间信息，参与细胞通讯和信号传递。细胞表面糖链结构的改变与疾病的发生、发展紧密相关。肿瘤细胞表面往往表现糖基异常化，导致糖链异常增多，如出现β（1，6）N-乙酰氨基葡萄糖过度表达，N-乙酰乳糖胺重复序列、唾液酸化和岩藻糖化升高等。这些变化可放大细胞内增殖信号，影响细胞间质的粘附、迁移和侵袭特性，导致肿瘤恶性增殖与转移。一方面肿瘤细胞间的间隙连接功能异常，一方面肿瘤细胞表面表达多种异常糖链，间隙连接与糖链在肿瘤中的异常增殖及转移中都起着重要作用，但两者的联系及糖链对肿瘤间隙连接功能形成的影响研究的较少。肿瘤细胞的一个重要特点之一是细胞膜表面唾液酸糖链含量增加。文献报道Birgit Rose小组采用衣霉素、苦马豆碱、粟精胺可以促进细胞间隙连接形成，促进细胞间隙功能增强。衣霉素、苦马豆碱、粟精胺作用可使细胞表面产生含有不同单糖组成的糖链，进而影响唾液酸在糖链的末端的形成，考虑到唾液酸在肿瘤中异常高表达是一种普遍现象，上述研究结果提示我们可能是肿瘤中细胞表面的唾液酸残基影响了肿瘤细胞的间隙连接功能，从而导致细胞间隙连接通讯降低，发生了肿瘤细胞的恶性增殖及转移。基于上述假设，本论文旨在利用多种手段，如分子生物学手段、激光共聚焦显微镜成像技术、流式细胞术，借助于化学调节剂观察唾液酸改变对细胞间隙连接功能的影响，在此基础上观察唾液酸糖链改变前后连接蛋白的表达、磷酸化水平及细胞上分布及动态变化，分析与连接蛋白相互作用的其它蛋白，探讨唾液酸对细胞间隙连接功能影响的机制。该论文的研究将从一个侧面阐明肿瘤异常糖链对肿瘤发生发展的影响，为糖生物学前沿探索性研究提供实验依据。第一部分：α—（2，3）／（2，6）唾液酸对肿瘤细胞Cx43间隙连接功能的影响第一章构建Hela-Cx43、Hela-Cx43-EGFP稳定细胞株采用逆转录病毒载体pBABE，成功构建了稳定高表达的Hela-Cx43、Hela-Cx43-EGFP细胞株，为后续的研究提供实验材料。第二章α—（2，3）／（2,6）唾液酸对肿瘤细胞Cx43间隙连接功能的影响1．衣霉素抑制Hela细胞膜表面N-糖链的生成，引起间隙连接功能显著增强。2．瞬时干扰Hela细胞糖基转移酶GnTV，降低细胞膜表面β1，6分支，促进间隙连接功能。3．唾液酸酶降低Hela细胞膜表面唾液酸，间隙连接功能显著增强。4．唾液酸酶抑制剂增加NIH-3T3细胞表面唾液酸，间隙连接功能显著降低。5、NIH-3T3-STX高表达α2,8 sialic acid，间隙连接功能无明显变化。上述实验结果表明，肿瘤细胞中唾液酸的高表达，参与介导了细胞间隙连接功能的降低，并且这种降低主要与α2,3 sialic acid与α2,6 sialic acid有关，而与α2,8 sialic acid无关。上述结果也说明了肿瘤由于唾液酸的增加促进肿瘤发生发展与细胞间隙连接功能降低有关。第二部分：α—（2，3）／（2，6）唾液酸对肿瘤细胞CX43间隙连接功能影响的机制研究1、Westernblotting结果表明降低细胞膜表面唾液酸并不改变Cx43的表达及其磷酸化水平：但Cx43连接斑形成增多；2、Westernblotting结果表明唾液酸酶作用后细胞ZO—1表达没有改变，IP及免疫荧光共定位结果表明唾液酸酶作用后促进了Cx43与ZO-1的结合；3、Westernblotting结果表明唾液酸酶作用后细胞N-cadherin表达没有改变，IP及免疫荧光共定位结果表明唾液酸酶作用后促进了Cx43与N-Cadherin复合物的形成；4、唾液酸酶作用后细胞内ERK1／2磷酸化水平明显增加，细胞间同质粘附增加，以及免疫荧光表明唾液酸降低后可促进N-cadherin的膜成簇。β-catenin可通过α-catenin介导和细胞骨架系统（如微管蛋白）相连，IP及免疫荧光共定位结果发现唾液酸酶作用后促进了细胞β—catenin与N-cadherin的结合，IP实验结果表明唾液酸酶作用后Cx43与β-catenin结合增多；5、免疫荧光实验表明唾液酸酶作用后CX43与微管末端共定位增加；6、FRAP实验结果表明降低细胞膜表面唾液酸能加快Cx43连接斑形成；7、Pull down实验结果表明唾液酸酶作用后N-cadherin分子上唾液酸修饰明显减少。上述结果表明，N-cadherin分子的唾液酸减少后，能够导致细胞上N-cadherin在细胞间聚集成簇，引起ERK1／2磷酸化水平增加，促进N-cadherin通过β-catenin与细胞骨架的结合，进而导致Cx43从胞内转运至细胞膜上，并与Z0—1结合增多，促进膜上连接斑的形成，从而促进CX43细胞间隙连接功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 α—（2,3）/（2,6）唾液酸对肿瘤细胞Cx43间隙连接功能的影响
• 第一章 构建Hela-Cx43、Hela-Cx43-EGFP稳定细胞株
• 1.1、前言
• 1.2、实验材料
• 1.2.1 实验试剂与材料
• 1.2.2 常用缓冲液及其他溶液
• 1.2.3 实验仪器
• 1.2.4 实验菌种
• 1.2.5 逆转录病毒表达载体
• 1.3、实验方法
• 1.3.1 Cx43和Cx43-EGFP目的基因片段的获得
• 1.3.2 pBABE-puro逆转录病毒表达载体的构建
• 1.3.3 质粒对靶细胞的感染
• 1.4、实验结果
• 1.4.1 小量抽提pEGFP-N1-hCx43以及测序质粒鉴定结果
• 1.4.2 PCR扩增
• 1.4.3 pBABE-puro载体的抽提
• 1.4.4 pBABE-puro载体及PCR产物的双酶切以及胶回收
• 1.4.5 pBABE-Cx43&pBABE-Cx43-EGFP重组表达载体的鉴定
• 1.4.6 pBABE-Cx43和pBABE-Cx43-EGFP细胞株的鉴定
• 1.5、讨论
• 1.6、小结
• 第二章 α—（2,3）/（2,6）唾液酸对肿瘤细胞Cx43间隙连接功能的影响
• 2.1、前言
• 2.2、实验材料和方法
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 常用缓冲液及其他溶液
• 2.2.4 实验方法
• 2.3、实验结果
• 2.3.1 TM作用对Hela细胞间隙连接功能的影响
• 2.3.2 iRNA-GnTV瞬时干扰对Hela细胞Cx43间隙连接功能的影响
• 2.3.3 唾液酸酶作用对Hela细胞Cx43间隙连接功能的影响
• 2.5、讨论
• 2.6、小结
• 第二部分 α—（2,3）/（2,6）唾液酸对肿瘤细胞Cx43间隙连接功能影响的机制研究
• 3.1、摘要
• 3.2、前言
• 3.3、实验材料和方法
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 实验方法
• 3.4、实验结果
• 3.4.1 唾液酸酶对Hela细胞内Cx43表达水平及磷酸化水平的影响
• 3.4.2 唾液酸酶作用对HeLa细胞Cx43于Triton X-100溶解性的影响
• 3.4.3 唾液酸酶作用对Hela细胞ZO-1表达及其与Cx43的结合的影响
• 3.4.4 唾液酸酶作用对HeLa细胞内N-Cadherin表达及与相关蛋白结合的影响
• 3.4.5 唾液酸酶作用对HeLa细胞间同质粘附的影响
• 2.4.6 唾液酸酶作用对同质粘附中信号分子ERK磷酸化水平的影响
• 3.4.7 激光共聚焦显微镜检测唾液酸酶作用后对Cx43连接斑形成的 影响
• 3.4.8 唾液酸酶作用对N-Cadherin分子上唾液酸修饰的影响
• 3.5、讨论
• 3.6、小结
• 参考文献
• 结论与创新
• 发表的学术论文
• 致谢