苏云金芽胞杆菌芽胞和晶体形成相关功能基因研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）作为一类微生物农药,因其杀虫效果好、对人畜安全、不污染环境等优点而得到广泛应用,约占整个生物农药市场的90%。与芽胞杆菌属其它种相比,Bt的一个显著特点就是在形成芽胞的同时能够产生杀虫晶体蛋白（ICPs）。枯草芽胞杆菌作为模式菌株,有关芽胞形成的机制研究相对深入,而针对Bt杀虫晶体的形成机制的研究还主要集中于杀虫晶体蛋白基因的表达调控,关于晶体和芽胞形成相关基因关系的报道还很少。因此,本研究通过对功能基因组学相关方法的运用,初步研究了苏云金芽胞杆菌中分别位于染色体和质粒上的两个基因,并对它们对芽胞和晶体形成的作用加以阐述,这将有助于阐明Bt芽胞、晶体形成机制,为改造更为安全、高效的工程菌株提供理论依据。本研究利用携带Mini-Tn10转座子的pIC333温敏载体,完成了B. thuringiensis HD73的转座子突变体库的构建,获得了20,000株具有壮观霉素抗性的突变体,并完成了突变体库的鉴定。经过筛选,获得两株不能产生芽胞和晶体的突变株。通过对突变株转座子侧翼序列的分析,确定了插入位点分别位于染色体上copG基因和质粒上尚无任何报道的一条基因（命名为11sc）内部,分别造成了9个碱基的重复,并研究了突变株产生芽胞、晶体的能力。因此,将突变株分别命名为HD73（copG）::Mini-Tn10和HD73（11sc）::Mini-Tn10。进一步构建了敲除copG部分和全部基因载体,分别命名为pRN5101（copG△’）及pRN5101（copG△）,将其分别导入HD73出发菌株,经高温诱导突变,筛选获得了缺失相应基因的突变株,分别命名为HD73（copG△’）和HD73（copG△）。镜检结果显示,虽然杀虫蛋白的量较出发菌株少,但突变株依然有产生芽胞和晶体的能力。构建敲除11sc全部基因载体pRN5101（11sc△）,经转化、突变、筛选后获得相应突变株HD73（11sc△）,但仍未丧失产生芽胞、晶体的能力。对cry1Ac基因扩增及SDS-PAGE分析结果表明,突变株中均未丢失cry1Ac基因。突变株表现型结果表明,copG和11sc基因的缺失不能严重影响芽胞和晶体的形成,不是调控芽胞和晶体形成的主效基因。相关研究仍需要进一步深入分析转座子Mini-Tn10插入突变在破坏以上基因的同时还可能影响到其它基因的表达,单独或共同导致了插入突变株完全丧失了产生芽胞、晶体的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 芽胞和杀虫晶体蛋白
• 1.1.1 芽胞
• 1.1.2 杀虫晶体蛋白
• 1.2 copG 基因
• 1.2.1 结构
• 1.2.2 功能及研究进展
• 1.3 苏云金芽胞杆菌基因组研究概况
• 1.4 转座子的随机插入突变
• 1.5 同源重组敲除技术
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基与抗生素
• 2.1.3 酶与生化试剂
• 2.1.4 常用溶液与缓冲液
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 转座子突变体库的构建和筛选
• 2.2.2 copG 基因的功能研究
• 2.2.3 11sc 基因功能研究
• 3 结果与分析
• 3.1 HD73 菌株突变体库的构建与鉴定
• 3.1.1 突变体库的构建
• 3.1.2 抗性鉴定
• 3.1.3 PCR 鉴定
• 3.1.4 突变株芽胞和晶体的观察
• 3.1.5 突变株cry 基因型的鉴定
• 3.2 筛选获得了两株丧失产生芽胞和晶体能力的突变株
• 3.2.1 copG 基因的功能研究
• 3.2.2 11sc 基因的功能研究
• 3.2.3 突变株产杀虫蛋白能力的分析
• 4 讨论
• 4.1 转座子及同源重组技术
• 4.2 无芽胞和无晶体突变株的筛选
• 4.3 敲除基因的研究
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文