论文摘要
目的1.构建稳定表达HBx的转基因细胞模型L02/HBx细胞。2.检测L02/HBx细胞中,HBx蛋白与Notch及NF-κB的结合能力,研究HBx蛋白对Notch与NF-κB信号通路的作用方式与机制,从信号通路这一角度探讨HBx在肝细胞癌发生机制中的作用。3.检测L02/HBx细胞中Notch信号通路阻断后,NF-κB的功能亚基p50、p65及抑制因子IκBαmRNA与蛋白表达的改变,同时检测NF-κB DNA结合活性的变化,探讨Notch与NF-κB信号通路在L02/HBx细胞中的串话作用机制及其在肝细胞恶性转化及乙肝相关性肝癌发生中的作用。方法1.传代培养由课题组林松挺前期构建的稳定表达HBx的转基因细胞模型L02/HBx细胞。2.应用免疫共沉淀法检测转基因细胞株L02/HBx细胞中HBx蛋白与Notch1 （NICD、Jagged1）及NF-κB （p50、p65、IκBα）的结合能力,同时采用细胞免疫荧光技术和激光共聚焦显微镜测定L02/HBx细胞中HBx与NICD两种蛋白的共定位情况。3.应用含有20μM DAPT的DMEM培养L02/HBx细胞48h（DAPT组）,阻断Notch信号通路,以含有0.05%DMSO的DMEM培养L02/HBx细胞48h（DMSO组）及普通DMEM培养的L02/HBx细胞作为对照组,并应用免疫印记法检测这三组细胞中NICD蛋白量的改变。4.应用凝胶迁移率实验检测NF-κB的DNA结合活性在DAPT组、DMSO组、L02/HBx组三组细胞中的改变。5.应用RT-实时PCR定量检测NF-κB （p50、p65、IκBα） mRNA在DAPT组及对照细胞DMSO组、L02/HBx组细胞中的表达;同时应用免疫印记法检测这三组细胞中p50、p65蛋白在胞浆和胞核中的变化及IκBα总蛋白的改变。结果1.免疫共沉淀和免疫荧光试验发现L02/HBx细胞中HBx蛋白可与NICD结合,而不能与Jagged1、p50、p65及IκBα结合。2.应用免疫印记法测定L02/HBx+DAPT（DAPT组）、L02/HBx+DMSO（DMSO组）、L02/HBx组三组细胞中NICD的蛋白含量,结果显示与对照组细胞相比DAPT组细胞中NICD的蛋白含量显著降低,而对照组DMSO与L02/HBx细胞中NICD的蛋白含量无显著差异。3.凝胶迁移率实验检测NF-κB的DNA结合活性,结果显示与对照组细胞相比DAPT组细胞中NF-κB的DNA结合活性显著降低,而对照组DMSO组与L02/HBx组细胞中NF-κB的DNA结合活性无明显差异。4.实时定量PCR定量检测发现NF-κB功能亚基p65 mRNA在DAPT组（0.466667±0.027285）细胞中的表达显著低于DMSO组（0.97±0.045092）和L02/HBx（1±0.049329）细胞（p<0.01）;NF-κB功能亚基p50 mRNA在DAPT组（0.43±0.01）细胞中的表达显著低于DMSO组（1.01±0.01）和L02/HBx（1±0.04）细胞（p<0.01）;相反NF-κB抑制因子IκBαmRNA在DAPT组（1.38±0.025166）细胞中的表达显著高于DMSO组（1.006667±0.012019）和L02/HBx（0.995±0.095）细胞（p<0.01）;p50、p65及IκBαmRNA各自在两组对照细胞中无显著差异。5.免疫印记法测定各组细胞中的p50、p65及IκBα的蛋白含量,结果显示与对照细胞相比DAPT组细胞中,p50及p65蛋白在胞核中的含量显著降低,而在胞浆中无显著差异;IκBα总蛋白含量则显著升高;p50和p65蛋白含量在两组对照细胞胞浆及胞核中及IκBα含量在两组对照细胞总蛋白中均无显著差异。结论1. HBx蛋白可与Notch受体胞内段NICD直接结合,而不与其配体Jagged1结合,这种直接结合作用可激活Notch信号通路;2. Notch1信号通路的激活可以在转录水平上上调NF-κB功能亚基p50、p65的表达,下调NF-κB抑制因子IκBα的表达,促进p50、p65蛋白向核内转移,还可增加核蛋白NF-κB的DNA结合活性,引起下游一系列基因的活化;3. HBx不能通过与p50、p65或IκBα的结合参与NF-κB信号通路的调控,可能是通过与Notch信号通路的直接作用,进而与NF-κB信号通路发生串话,最终激活NF-κB信号通路参与肝细胞的恶性转化和乙肝相关性肝癌的发生。
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