干扰乳腺癌微环境基础上提高免疫治疗疗效的研究

论文摘要

肿瘤的发生、发展不仅取决于肿瘤细胞自身,还与其所处的环境密切相关。早在1889年Stephen Parget就提出了“种子与土壤”的假说,用来描述肿瘤与微环境之间的关系。乳腺癌微环境是乳腺癌局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等与乳腺癌细胞共同构成的局部内环境。乳腺癌和微环境之间既是相互依存,相互促进,又是相互拮抗,相互斗争的。通过一些方法改变或影响微环境内的某些因素,在某种程度上会延缓肿瘤的进展程度,提高患者的生存期。目前,临床上乳腺癌的治疗仍以手术、化疗、放疗和内分泌治疗为主。这些传统的治疗方法对于一些早中期乳腺癌患者能起到非常好的治疗效果。但是,对于一些晚期伴有远处转移的乳腺癌患者,却不能很好的控制病变的发展。随着免疫学的发展,肿瘤免疫治疗在体外研究和动物实验中均取得了显著的治疗效果,而临床应用目前仅限于I、II期临床试验且疗效欠佳。究其原因,这与微环境内复杂的免疫调节网络密切相关,而微环境内的免疫耐受是导致这种情况发生的最为关键的因素。诱导微环境内免疫耐受有很多机制,其中微环境内抑制性细胞和一些抑制性细胞因子的作用最为重要。调节性T细胞（Treg）是一类具有特殊调节功能的T细胞亚群,可以通过多种方式浸润到微环境中抑制效应淋巴细胞功能,维持抗原特异性免疫耐受。研究表明,Treg在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌等多种常见人体肿瘤中被发现,同时观察到肿瘤局部T细胞功能受到明显的抑制。有的研究者通过“抑制”或“沉默”Treg细胞的免疫抑制功能后,发现免疫耐受状态得到逆转,肿瘤免疫治疗效果得到增强。最初研究认为,调节性T细胞就是CD4+CD25+Treg,随着研究深入,发现Foxp3+特异性表达于Treg的细胞核内,是Treg发育、活化和发挥功能的关键。因此认为,CD4+、CD25+和Foxp3+三标检测更能真实反映Treg的水平。转化生长因子-β（TGF-β）是介导肿瘤免疫逃逸最有效的免疫抑制因子,能广泛抑制肿瘤患者的免疫系统使肿瘤细胞逃避机体免疫监视功能而迅速增殖。研究表明TGF-β在前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤中呈过度表达,可以由肿瘤细胞表达,也可以由多种基质细胞表达,其过度表达可以导致肿瘤转化、进展,甚至也可以决定患者预后。白细胞介素-10（IL-10）是在肿瘤免疫中发挥着显著作用的免疫抑制性细胞因子。IL-10通过抑制抗原提呈细胞和T淋巴细胞的功能促进肿瘤生长,发挥免疫抑制作用。传统的观点认为,放疗或化疗之后,机体的免疫系统受抑,不适宜进行免疫治疗。但是,随着研究的深入,发现一定量的放疗或化疗可以对微环境起到免疫调节作用,进而增强免疫治疗的疗效。树突状细胞（DCs）是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞,具有强大的T细胞激活能力,能显著刺激初始型T细胞、B淋巴细胞、NK细胞的增殖和活性。因此,DCs是机体免疫反应的始动者,在免疫应答中具有重要地位,以DCs为基础的肿瘤疫苗在肿瘤免疫治疗中占有重要位置。本实验通过检测CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10在人乳腺癌中的表达,探讨其在乳腺癌发生、发展及转移中的作用;通过建立BALB/c小鼠乳腺癌模型并给予放化疗干预后,根据乳腺癌微环境中Treg的表达情况,确定最佳干预方式;在干预治疗的基础上联合树突状细胞（DCs）疫苗,探讨其疗效及不同治疗方法对微环境中TGF-β和IL-10的影响。从而为临床化放疗联合免疫治疗提供一定的理论依据。第一部分人乳腺癌微环境中CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10的表达及意义目的:探讨CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10在诱导乳腺癌免疫耐受中的作用和可能机制。方法:选取河北医科大学第二医院腺体外科乳腺癌标本40例（淋巴结无转移20例,转移20例）、乳腺纤维腺瘤标本20例,分别应用流式细胞术（FCM）检测CD4+CD25+Foxp3+Treg,应用免疫组织化学法检测TGF-β和IL-10在乳腺癌原发灶、癌周组织、腋窝淋巴结以及乳腺纤维腺瘤中的表达。结果:乳腺癌原发灶中三指标表达程度,均较乳腺纤维腺瘤中高（P<0.05）;原发灶中表达程度,均高于癌周组织和腋窝淋巴结（P<0.05）;淋巴结转移组中癌周组织三项指标表达低于腋窝淋巴结（P<0.05）,而淋巴结未转移组中,癌周组织和腋窝淋巴结表达无统计学意义（P>0.05）。第二部分化放疗联合DCs疫苗对BALB/c小鼠乳腺癌微环境中CD4+CD25+Foxp3+Treg的影响目的:观察不同治疗方法对BALB/c小鼠乳腺癌微环境中CD4+CD25+Foxp3+Treg的影响及意义。方法:将96只BALB/c小鼠随机分为4组,每组24只。以4T1乳腺癌细胞株皮下接种建立BALB/c小鼠乳腺癌模型,接种后16天开始治疗。根据治疗方式不同,分为①对照组、②化疗组、③放疗组、④化疗+放疗组。其中,每组小鼠再根据处死时间的不同随机分为2个亚组,每个亚组12只。应用FCM测定4T1细胞接种后20、24天乳腺癌组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达,根据表达程度确定一个最佳干预组。再选取48只BALB/c小鼠随机分为4组,每组24只。以4T1乳腺癌细胞株皮下接种建立BALB/c小鼠乳腺癌模型,接种后16天开始治疗。根据治疗方式不同,分为⑤DCs疫苗组、⑥化疗+放疗+DCs疫苗组。其中,每组小鼠再根据处死时间的不同随机分为2个亚组,每个亚组12只。应用FCM测定4T1细胞接种后20、24天乳腺癌组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达结果:①CD4+CD25+Foxp3+Treg在化疗组、放疗组和化疗+放疗组接种后20天均较对照组显著下降（P<0.05）;②CD4+CD25+Foxp3+Treg在化疗+放疗组接种后20天又显著低于化疗组和放疗组（P<0.05）;③在DCs疫苗组接种后24天显著低于对照组和化疗+放疗组（P<0.05）;④在化疗+放疗+DCs疫苗组接种后20、24天均显著低于对照组、放疗+化疗组和DCs疫苗组（P<0.05）。第三部分化放疗联合DCs疫苗对BALB/c小鼠乳腺癌微环境中TGF-β和IL-10的影响目的:观察不同治疗方法对BALB/c小鼠乳腺癌微环境中TGF-β和IL-10的影响及意义。方法:将144只BALB/c小鼠随机分为6组,每组24只。以4T1乳腺癌细胞株皮下接种建立BALB/c小鼠乳腺癌模型,接种后16天开始治疗。根据治疗方式不同,分为①对照组、②化疗组、③放疗组、④化疗+放疗组、⑤DCs疫苗组、⑥化疗+放疗+DCs疫苗组。其中,每组小鼠再根据处死时间的不同随机分为2个亚组,每个亚组12只。应用免疫组织化学法测定4T1细胞接种后20、24天乳腺癌组织中TGF-β和IL-10的表达（小鼠及分组与第二部分重复）。结果:①TGF-β和IL-10在化疗组中表达与对照组无统计学意义（P>0.05）;②TGF-β和IL-10在放疗组接种后20天显著低于对照组（P<0.05）;③TGF-β和IL-10在化疗+放疗组接种后20天显著低于对照组及化疗组（P<0.05）,但与放疗组间无统计学意义（P>0.05）。④TGF-β和IL-10在DCs疫苗组接种后24天显著低于以上四组（P<0.05）;⑤TGF-β和IL-10在化疗+放疗+DCs疫苗组接种后20、24天均显著低于以上五组（P<0.05）。结论:1、CD4、CD25和Foxp3三标流式细胞学检测能更准确的反映乳腺癌组织中Treg的水平。2、随着肿瘤的进展,乳腺癌组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10的水平是逐渐升高的。3、CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10在诱导乳腺癌微环境内的免疫耐受中发挥着重要作用。4、化放疗联合治疗对于乳腺癌微环境的影响明显优于单纯化疗和单纯放疗。化疗和放疗只对乳腺癌微环境起免疫调节作用,不能产生有效的抗肿瘤免疫;化放疗干预乳腺癌微环境基础上给予DCs疫苗较单纯应用DCs疫苗能显著增强其治疗效果。5、乳腺癌微环境中增高的CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10在抑制DC功能中发挥了一定作用。6、化放疗联合治疗可通过直接杀伤肿瘤细胞和减少Treg的数量和功能,降低乳腺癌微环境内TGF-β和IL-10的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 引言
• +CD25⁺Foxp3⁺Treg、TGF-β和IL-10 的表达及意义'>第一部分 人乳腺癌微环境中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg、TGF-β和IL-10 的表达及意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• +CD25⁺Foxp3⁺Treg 的影响前言'>第二部分 化放疗联合 DCs 疫苗对 BALB/c 小鼠乳腺癌微环境中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg 的影响前言
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 化放疗联合 DCs 疫苗对 BALB/c 小鼠乳腺癌微环境中 TGF-β 和 IL-10 的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历