晚期糖基化终产物及其受体系统对血管外膜成纤维细胞的功能影响

论文摘要

血管外膜通过直接或间接作用对血管的结构和功能调节起着重要的调控作用。血管外膜成纤维细胞（AF）是血管外膜的主要细胞成分,在动脉粥样硬化发生发展、不良血管重塑和血管再狭窄起重要作用。晚期糖基化终产物（AGEs）与AF参与糖尿病相关并发症,组织AGEs浓度与动脉粥硬化斑块的严重程度相关,AGEs的直接作用以及其与受体结合后的效应,均可引起致动脉粥样硬化相关细胞以及多种因子的激活。糖尿病患者及老年人群血管外膜中AGEs逐渐堆积,对AF等外膜细胞产生影响,但其内部机制仍不甚了解,本研究从AGEs对AF细胞迁移、氧化应激及相关炎症反应方面进行探讨。主要内容分五部分:第一部分晚期糖基化终产物对血管外膜成纤维细胞糖基化终产物受体表达的影响目的:探讨AGEs对AF晚期糖基化终产物受体（Receptor for Advanced Glycation Endproducts,RAGE）表达的影响。方法:用组织贴块法培养SD大鼠的AF。荧光免疫细胞化学鉴定细胞。细胞同步化处理,分别加入不同浓度（50、100、150、200、300μg/ml）的晚期糖基化人血清白蛋白（Advanced Glycation Endproducts-Human Serum Albumin, AGE-HSA）干预24小时,以200μg/ml人血清白蛋白（Human Serum Albumin,HSA）作为对照。用RT-PCR和Western-blot技术检测RAGE基因和蛋白的表达。结果: 50、100、150、200、300μg/ml的AGE-HSA可分别上调RAGE mRNA和蛋白的表达,且RAGE表达150μg/ml、200μg/ml、300μg/ml组与对照组差异显著（P<0.05）,200μg/ml时达到峰值（P<0.05）。该效应可被p38拮抗剂、ERK1/2拮抗剂、JNK拮抗剂、坎地沙坦抑制。结论:AGEs能够上调AFs RAGE的表达,坎地沙坦能够抑制该效应。第二部分晚期糖基化终产物促进血管外膜成纤维细胞迁移机制及坎地沙坦的干预作用研究目的:观察AGEs对AF迁移的影响,探讨其机制及观察坎地沙坦干预作用。方法:用组织贴块法培养SD大鼠的AF,用transwell小室检测AGE-HSA对AF迁移的影响。用免疫印迹技术观察AGE-HSA对AF丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路磷酸化影响。结果: AGE-HSA可促进p38、ERK1/2、JNK磷酸化,JNK在20min,p38、ERK1/2在30min达峰值（P<0.05）。p38拮抗剂、ERK1/2拮抗剂、JNK拮抗剂分别抑制p38、ERK1/2、JNK磷酸化,RAGE中和抗体、坎地沙坦可抑制p38、ERK1/2、JNK磷酸化。不同浓度AGE-HSA（50,100,150,200,300μg/ml）可促进血管外膜成纤维细胞的迁移,200μg/ml时达到峰值（P<0.05）。RAGE中和抗体、p38拮抗剂、ERK1/2拮抗剂、坎地沙坦均可抑制AGE所致成纤维细胞的迁移（P<0.01）。结论:AGEs经由RAGE影响MAPK通路促进血管外膜成纤维细胞迁移,坎地沙坦可通过阻断此途径抑制血管外膜成纤维细胞迁移,这可能是其血管保护作用的新机制。第三部分晚期糖基化终产物对血管外膜成纤维细胞氧化应激激活机制的研究目的:观察AGEs对AF氧化应激的影响,探讨其作用机制。方法:用组织贴块法培养SD大鼠的AF,用DCFH-DA检测AGE-HSA对AF ROS表达的影响。用RT-PCR、Western-blot检测NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox表达。结果: AGE-HSA可分别从基因和蛋白水平上调p22phox、p47phox的表达。氧化酶抑制剂DPI（diphenyliodonium）、APO（apocynin）、抗RAGE中和抗体、坎地沙坦可以抑制由AGE-HSA刺激引起的p22phox、p47phox表达上调（P<0.05）。AGE-HSA可促进ROS的表达上调。氧化酶抑制剂DPI、APO、抗RAGE中和抗体、坎地沙坦可以抑制由AGE-HSA刺激引起ROS的表达上调。结论:AGE-HSA经由RAGE影响ROS与p22phox、p47phox的表达上调,ROS的上调与p22phox、p47phox表达相关。NADPH氧化酶抑制剂及坎地沙坦可通过下调p22phox、p47phox的表达减少AF内ROS的产生。第四部分晚期糖基化终产物促进血管外膜成纤维细胞炎症反应机制及坎地沙坦干预研究目的:观察AGEs对AF炎症反应影响的机制及坎地沙坦干预作用。方法:用组织贴块法培养SD大鼠的AF, RT-PCR检测MCP-1、IL-6、VCAM-1 mRNA表达,ELISA检测培养液上清MCP-1、IL-6、VCAM-1。Western-blot及EMSA检测NF-κB和I-κB-α。结果:AGE-HSA 200μg/ml作用AF后0.5h、1h、2h核内NF-κB转录活性增强,作用后0.5h、1h I-κB-α磷酸化。AGE-HSA 200μg/ml处理促进NF-κB核内移,加用坎地沙坦可抑制NF-κB核内移,I-κB-α磷酸化也可被坎地沙坦抑制。不同浓度AGE-HSA（50、100、200、300μg/ml）均可使AF IL-6、VCAM-1、MCP-1 mRNA表达上调,50、100μg/ml与对照组比较mRNA表达量有显著差异（P<0.05）,200、300μg/ml与对照组比较mRNA表达量有显著差异（P<0.01）。用RAGE中和抗体、NF-κB抑制剂MG-132、坎地沙坦预处理可减少由AGE-HSA所致IL-6、VCAM-1、MCP-1 mRNA表达及上清中蛋白的浓度（P<0.05）。结论:AGE-HSA通过RAGE、NF-κB途径促使炎症因子表达上调。坎地沙坦可有效抑制I-κB-α磷酸化、NF-κB核内移、炎症因子表达,提示其具有糖尿病血管并发症的治疗作用。第五部分血管外膜成纤维细胞的galectin-3表达及galectin-3基因的RNA干扰目的:观察AF半乳糖凝集素-3（galectin-3）表达,构建galectin-3 RNA干扰慢病毒载体,观察AGEs受体galectin-3对血管成纤维细胞功能影响。方法:RT-PCR检测galectin-3表达,设计RNA干扰靶点序列,合成后galectin-3短发夹RNA克隆到慢病毒载体,限制性内切酶分析和测序鉴定重组载体。工作载体和包装质粒共转染293T细胞,72小时后收集慢病毒,加入培养的血管成纤维细胞。Western blot检测半乳糖凝集素-3表达。结果:50、100、150、200、300μg/ml的AGE-HSA可分别从基因和蛋白水平上调galectin-3的表达。筛选出galectin-3的RNAi有效靶点,成功构建了galectin-3小RNA干扰的慢病毒载体,该载体能有效转染AFs,目的蛋白galectin-3达到有效敲减。结论:构建的慢病毒载体可有效抑制外膜成纤维细胞galectin-3的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要英文缩略词表
• 前言
• 第一部分 AGEs 对AFs RAGE 表达的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二部分 晚期糖基化终产物促进血管外膜成纤维细 胞迁移机制及坎地沙坦的干预作用研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三部分 晚期糖基化终产物对血管外膜成纤维细胞氧 化应激激活机制的研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第四部分 晚期糖基化终产物促进血管外膜成纤维细 胞炎症反应机制及坎地沙坦干预研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第五部分 血管外膜成纤维细胞的 galectin-3 表达及 galectin-3 siRNA 慢病毒载体的构建
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 论文总结
• 综述一
• 综述二
• 参考文献
• 在读期间发表论文情况说明
• 致谢