论文摘要
白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤。迄今,白血病的治疗仍主要采用大剂量联合化疗,此疗法副作用甚大,复发率高,尤其对机体免疫与造血系统有极大损害。研究恶性肿瘤尤其是白血病细胞的诱导分化及逆转机制已成为当今生物医学领域内最为热门的前沿课题之一。在众多的研究中,中药以其增强免疫功能,功补兼施、毒副作用小,注意整体,应用范围广泛的优越性得到了广泛认可和重视。从祖国医学宝库中寻找出既能促进正常造血、又能抑制白血病细胞恶性增殖,并诱导其向成熟方向分化的天然诱导分化剂已成为治疗白血病的希望和重要途径。目的:本课题组前期研究已证明当归多糖(APS)在体内外均能促进人与小鼠造血干细胞和造血祖细胞的增殖分化,并能有效抑制白血病细胞的增殖,但其机理尚不清楚。在红系血细胞发生中,促红细胞生成素(Epo)与造血细胞膜上相应受体结合起着关键性的作用,研究表明JAK2激酶及其下游信号蛋白分子–信号转导和转录激活因子5(STAT5)在Epo介导的信号转导中起着重要作用。本研究旨在探讨APS对K562细胞增殖抑制及定向红系细胞分化的影响,并采用研究造血生长因子信号转导途径的方法,选择JAKs/STATs通路探讨APS参与造血调控的分子机制,进一步阐述当APS调节造血细胞增殖分化的生物学机理,为其临床用药和药物开发提供理论及实验依据。方法:1、采用细胞体外培养技术,MTT法、台盼蓝拒染法与流式细胞术检测APS对K562细胞增殖的影响;2、光镜观察细胞形态学变化;3、联苯胺染色与分光光度法检测经APS诱导后K562细胞向红系分化的特征和血红蛋白含量的变化;4、实验分组:阴性对照组,常规方法培养;阳性对照组,常规培养基础上加入羟基脲(终浓度100μmol/L);APS组,常规培养基础上加APS(终浓度100～500 mg/L),各组K562细胞培养不同时间后收集细胞,Western blotting法检测核、浆蛋白中JAK2、STAT5的表达变化;5、免疫细胞化学技术和激光共聚焦显微镜观察不同浓度APS分别作用K562细胞不同时间JAK2、STAT5的分布;6、阴性对照组和APS组(200 mg/L)于培养24h加入Epo(5×103 IU/L)刺激,Western blotting法检测APS协同Epo刺激不同时间,K562细胞核、浆蛋白中的JAK2和STAT5的表达;7、免疫沉淀法检测其活性;8、免疫细胞化学技术和荧光显微镜观察其分布。结果:1、APS对K562细胞的增殖有明显的抑制作用,抑制强度与APS的剂量和作用时间密切相关;2、流式细胞术检测显示APS 200 mg/L作用K562细胞第3d处于增殖活跃期的细胞数减少;3、形态学观察表明经APS诱导后K562细胞体积缩小,核直径减小,核仁减少或消失,核染色质浓缩,胞浆量丰富,核浆比例降低,细胞趋向成熟;4、经APS诱导后K562细胞的联苯胺染色阳性率增高,合成血红蛋白的量提高,APS诱导K562细胞合成血红蛋白与其作用浓度有密切关系;5、APS作用K562细胞12h,细胞浆内STAT5表达较阴性对照组明显减少,72h时APS组与阴性对照组K562细胞相比浆蛋白STAT5表达未发现明显差异;6、APS组K562细胞培养12h、24h和48h,核蛋白中STAT5表达较阴性对照组增加,浆蛋白中则表达减少,72h时核蛋白中STAT5表达较阴性对照组减少;7、APS组与阴性对照组的K562细胞JAK2表达未观察到显著变化;8、在Epo刺激下APS组JAK2的活性较阴性对照组增强;9、APS协同Epo刺激K562细胞,其核中STAT5的表达及活性组较阴性对照组增强。结论:APS在体外对K562细胞有明显的增殖抑制作用,并能诱导其向红系细胞分化,提示APS对正常造血细胞和白血病细胞的作用存在双向调控;APS作用K562细胞48h以内能使STAT5从胞浆转移到胞核,并增强其活性,但在72h时STAT5核转位明显减少;APS对JAK2表达影响不明显,但能增强其活性,提示APS对正常和异常血细胞增殖与分化的双向调控作用与JAK2/STAT5信号转导通路有关。以上结论提示APS有可能成为抑制白血病细胞增殖并诱导其向成熟方向分化的天然诱导剂,具有深入研究的理论价值和广阔的临床应用前景。