鲜切荸荠/莲藕特异性变色机理及其控制研究

论文摘要

鲜切果蔬（Fresh-cut fruits and vegetables）是指任何果蔬经鲜切加工后,虽然形状发生改变,但仍然保持新鲜状态的产品。变色是直接限制鲜切果蔬产品流通和货架期的重要因素之一。荸荠（Eleocharis tuberosa（Roxb.）Roem.et. Schult）和莲藕（Nelumbo nucifern guertn）适宜鲜切加工,但鲜切荸荠在贮藏中会发生黄化,鲜切莲藕片则表现为两个表面变色不同的现象。本研究以鲜切荸荠和莲藕为试材,深入研究了它们在贮藏过程中发生的特异性变色现象,探讨了变色机理,并在此基础上研究了鲜切莲藕变色的方向性调控。本研究结果表明,鲜切荸荠表面黄化可能并非是酶促褐变的结果,因为除了贮藏初期,在鲜切荸荠贮藏过程中一直没有检测到常见的与褐变相关的酚类物质;两种酶促褐变的关键酶——多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）和过氧化物酶（Peroxidase,POD）在整个贮藏过程中不仅活性很低,而且变化平缓;采用抗坏血酸处理并不能有效延缓鲜切荸荠黄化的发生;进一步研究发现鲜切荸荠表面黄化物质的甲醇提取液在200400 nm范围内呈现三个明显的吸收峰,经化学鉴定推测是黄酮类物质或黄酮类和蒽醌类物质的混合物;此外,对鲜切荸荠的黄化表面组织进行培养分离得到五种微生物,通过形态学研究初步证实其中一种为地霉属（Geotrichum）真菌,其余四种分别属于盐水球菌属（Salinococcus）、链球菌属（Streptococcus）、黄杆菌属（Flavobacterium）和葡萄球菌属（Staphylococcus）细菌。其中地霉属真菌、链球菌属和葡萄球菌属细菌可导致鲜切荸荠严重黄化。鲜切莲藕片变色具有明显的方向性,具体表现为朝向藕梢的一面较朝向藕头的一面先变色,且变色严重,这一现象是由莲藕组织内部因素决定的。深入研究鲜切莲藕片的两个不同方向表面相关的生理发现,在两个表面中不但与褐变密切相关的因素——PPO、POD、PAL酶活性及膜脂过氧化程度存在着明显的不同,而且水分含量也有显著差异。进一步研究结果表明,水分不均衡是导致鲜切莲藕变色方向性的关键。贮藏过程中,朝向藕头面组织中的水分含量一直明显高于朝向藕梢面的组织。而莲藕组织水分减少量与PPO、POD酶活性之间呈高度正相关。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase,PAL）活性随着莲藕组织中水分的大量丧失,同样表现出上升趋势。水势和膜透性的差异可能是产生水分不平衡的原因所在。通过硫酸铵分步盐析和DEAE-Spharose离子交换柱、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱层析,从鲜切莲藕组织中分离纯化到PPO,分子量约为65.966.1。该酶最适反应温度为20℃,在40℃下较稳定;最适pH值约为6.0,pH 5.6pH 6.5之间最稳定,超过pH 6.5,稳定性下降;抗坏血酸、异抗坏血酸、L-半胱氨酸和亚硫酸钠几乎都可以完全抑制莲藕组织中PPO的活性,而EDTA-Na、柠檬酸、氯化钠和氯化钙对PPO均只表现出轻微的抑制作用;FeSO4、FeCl3、和CuSO4对莲藕组织中的PPO则表现出一定的激活作用。通过硫酸铵分步盐析、Sephadex G-75柱层析和DEAE-Sepharose离子交换柱,对鲜切莲藕组织中POD进行了部分分离纯化。该酶最适反应温度为30℃,热稳定性相对较差,随着温度的升高,POD活性随着时间的延长呈加速下降趋势;最适pH为6.0,在pH 4.4、pH 6.5和pH 9.0都比较稳定;抗坏血酸、L-半胱氨酸和亚硫酸钠对其有较强的抑制作用,Fe2+和Fe3+也表现出一定的抑制作用,并且Fe2+的抑制作用强于Fe3+,而CaCl2、NaCl和柠檬酸只表现出微弱的抑制作用; Cu2+对其表现出明显的激活作用。抗坏血酸虽然可以延缓鲜切莲藕组织褐变,但并不能改变变色的方向性,而且会产生紫边等现象,0.4 %的抗坏血酸护色效果最好;壳聚糖处理不仅可以减缓鲜切莲藕组织褐变的发生,并较为有效地解决了鲜切莲藕变色的方向性问题。采用壳聚糖涂膜的鲜切莲藕组织两个不同方向表面水分差异明显减少,并与壳聚糖浓度呈反比,壳聚糖涂膜对PAL、PPO和POD酶活性产生不同程度的抑制作用,并与壳聚糖浓度呈正比。其中1.5 %浓度的壳聚糖处理对PPO酶活性产生了强烈的抑制作用,使其整个贮藏过程中一直维持在非常低的水平;壳聚糖对POD酶活性也表现出一定的抑制作用,但抑制程度较PPO低。壳聚糖涂膜处理还抑制了膜脂过氧化作用。但采用壳聚糖处理会导致鲜切莲藕组织膜透性增大,而且低浓度的壳聚糖会诱发鲜切莲藕组织腐烂的发生。单独采用壳聚糖溶剂食用乙酸处理研究表明,其增加了组织膜透性,减小了鲜切莲藕两个不同方向表面水分的差异,从而消除了由其所引发的褐变相关酶活性的差异,当食用乙酸浓度达到1.8 %时,鲜切莲藕变色的方向性现象已基本消除。同时食用乙酸还明显降低了PAL酶活性,减少了酶促褐变底物酚类物质的生成;并对PPO酶也产生了强烈的抑制作用,对POD酶也表现出一定的抑制能力,阻止了膜脂的过氧化作用。因此食用乙酸在控制鲜切莲藕变色的方向性中起关键作用,但其浓度过高会导致组织色泽偏红,并且食用乙酸由于改变组织pH值可能是导致低浓度壳聚糖处理诱发腐烂的原因所在。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 鲜切荸荠黄化机理研究
• 第一节 鲜切荸荠黄化中褐变条件的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料和处理
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 荸荠组织中酚类物质的提取
• 1.2.2 鲜切荸荠中酚类物质的鉴定
• 1.2.2.1 薄层层析鉴定
• 1.2.2.2 液质联用鉴定
• 1.2.3 鲜切荸荠中酚类物质的变化
• 1.2.4 色度的测定
• 1.2.5 PAL 活性的测定
• 1.2.6 多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性的测定
• 1.2.7 总酚的测定
• 1.3 仪器和试剂
• 1.3.1 仪器
• 1.3.2 试剂
• 1.4 统计分析计算与作图
• 2 结果与分析
• 2.1 鲜切荸荠贮藏过程中的色泽变化
• 2.2 鲜切荸荠组织中酚类物质的研究
• 2.2.1 鲜切荸荠中酚类物质的薄层层析鉴定
• 2.2.2 鲜切荸荠中酚类物质的质谱鉴定
• 2.2.3 鲜切荸荠中酚类物质的HPLC 鉴定
• 2.2.4 鲜切荸荠中酚类物质的变化
• 2.3 鲜切荸荠组织中与褐变相关酶的活性变化
• 2.3.1 鲜切荸荠中PAL 活性的变化
• 2.3.2 鲜切荸荠中PPO 活性的变化
• 2.3.3 鲜切荸荠中POD 活性的变化
• 2.4 抗坏血酸对鲜切荸荠黄化影响研究
• 3 讨论
• 3.1 鲜切荸荠中酶促褐变底物——酚类物质
• 3.2 与鲜切荸荠褐变相关酶的研究
• 3.3 抗坏血酸对鲜切荸荠黄化的影响
• 第二节 鲜切荸荠中黄化物质的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料和处理
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 黄色物质的提取和波谱鉴定
• 1.2.2 黄色类物质的化学检验（吴光旭，2004）
• 1.2.3 总黄酮含量的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 鲜切荸荠中黄色类物质波谱扫描结果
• 2.2 鲜切荸荠黄色类物质的化学鉴定
• 2.3 鲜切荸荠贮藏过程中黄酮类物质的变化
• 3 讨论
• 第三节 鲜切荸荠黄化与微生物关系研究
• 1 材料和方法
• 1.1 病原菌的分离和纯化
• 1.2 病原菌致病性测定
• 1.3 鲜切荸荠色度测定
• 1.4 病原菌形态学研究
• 1.4.1 病原菌形态学观察（东秀珠等，2001）
• 1.4.1.1 G 染色
• 1.4.1.2 鞭毛鉴定
• 1.4.1.3 芽孢鉴定
• 1.4.2 扫描电镜观察
• 2 结果和分析
• 2.1 鲜切荸荠组织中分离得到的微生物
• 2.2 鲜切荸荠接种分离得到的微生物后的结果
• 2.3 鲜切荸荠组织中微生物鉴定
• 2.3.1 鲜切荸荠组织中微生物光学显微镜鉴定
• 2.3.2 鲜切荸荠组织中微生物电子显微镜观察结果
• 2.3.3 鲜切荸荠中微生物的初步判定
• 3 讨论
• 第二章 鲜切莲藕变色方向性的研究
• 第一节 鲜切莲藕变色方向性之求证
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 处理方法
• 2 结果和分析
• 3 结论
• 第二节 鲜切莲藕片不同方向表面的生理研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 处理方法
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 水分测定
• 1.3.2 丙二醛（MDA）含量的测定
• 2·^-1)含量的测定'>1.3.3 超氧自由基(O₂·^-1)含量的测定
• 1.3.4 脂氧合酶（LOX）活性的测定
• 1.3.5 PAL、POD 和PPO 活性、总酚以及色度的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 鲜切莲藕不同方向表面色泽的变化
• 2.2 鲜切莲藕不同方向表面水分含量变化
• 2.3 鲜切莲藕不同方向表面总酚含量的变化
• 2.4 鲜切莲藕不同方向表面与褐变相关酶活性的变化
• 2.4.1 鲜切莲藕不同方向表面PAL 活性在贮藏中的变化
• 2.4.2 鲜切莲藕不同方向表面PPO 活性的变化
• 2.4.3 鲜切莲藕不同方向表面POD 活性的变化
• 2.5 鲜切莲藕不同方向表面膜脂过氧化研究
• 2.5.1 鲜切莲藕不同方向表面贮藏过程中LOX 活性的变化
• 2.5.2 鲜切莲藕不同方向表面丙二醛（MDA）含量的变化
• 2·^-1 产生速率的变化'>2.5.3 鲜切莲藕不同方向表面贮藏过程中O₂·^-1产生速率的变化
• 3 讨论
• 第三节 鲜切莲藕变色方向性的进一步研究
• 1 材料和方法
• 1.1 水势的测定
• 1.1.1 材料和预处理
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 膜透性的测定
• 1.3 莲藕组织水分含量与褐变相关酶关系的研究
• 1.3.1 材料预处理
• 1.3.2 PAL、POD 和PPO 活性的测定
• 1.4 扫描电镜观察
• 2 结果和分析
• 2.1 影响水分的因素——不同方向表面水势的变化
• 2.2 影响水分的另一个因素——不同方向表面膜透性的变化
• 2.3 莲藕组织水分变化与PAL 的关系
• 2.4 莲藕组织水分变化与PPO 活性的关系
• 2.5 莲藕组织水分变化与POD 活性的关系
• 2.6 鲜切莲藕组织表面扫描电镜观察结果
• 3 讨论
• 3.1 鲜切莲藕表面水分差异产生的原因探讨
• 3.2 莲藕组织水分变化与褐变相关酶活性关系研究
• 第三章 鲜切莲藕组织中PPO/POD 分离纯化及其部分酶学性质研究
• 第一节 鲜切莲藕组织中PPO 的分离纯化及其性质研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料和处理
• 1.2 PPO 的分离纯化
• 1.2.1 酶的提取
• 1.2.2 DEAE-Sepharose 柱层析
• 1.2.3 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水柱层析
• 1.2.4 纯化酶液的处理
• 1.2.5 SDS-PAGE 垂直板电泳
• 1.2.6 SDS-PAGE 垂直板电泳测定纯酶相对分子量
• 1.2.7 葡聚糖G-100 凝胶过滤测定PPO 相对分子质量
• 1.3 PPO 活性和蛋白质含量的测定
• 1.4 PPO 最适反应温度
• 1.5 PPO 热稳定性研究
• 1.6 PPO 最适pH 研究
• 1.7 PPO 的pH 稳定性研究
• 1.8 不同化合物对PPO 活性的影响
• 1.9 底物亲和性的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 PPO 的分离纯化
• 2.2 酶纯度鉴定
• 2.3 PPO 的分子量测定
• 2.3.1 SDS-PAGE 垂直板电泳测定纯酶相对分子量
• 2.3.2 葡聚糖G-100 凝胶过滤测定PPO 相对分子质量
• 2.4 莲藕组织中PPO 性质研究
• 2.4.1 PPO 最适反应温度
• 2.4.2 PPO 的热稳定性
• 2.4.3 PPO 最适pH 值和对pH 稳定性
• 2.4.4 PPO 动力学性质
• 2.4.5 不同化合物对莲藕组织多酚氧化酶活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 多酚氧化酶的分离纯化
• 3.2 莲藕组织中PPO 的性质
• 3.2.1 莲藕组织PPO 的反应条件
• 3.2.2 鲜切莲藕组织中PPO 稳定性探讨
• 3.2.3 不同化合物对鲜切莲藕组织中PPO 的影响探讨
• 3.3 鲜切莲藕中PPO 的分子量
• 第二节 鲜切莲藕组织中POD 的分离纯化及其性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与处理
• 1.2 POD 的分离纯化
• 1.2.1 POD 粗酶液的提取
• 1.2.2 Sephadex G-75 柱层析
• 1.2.3 DEAE-Sepharose 柱层析
• 1.2.4 SDS-PAGE 垂直板电泳
• 1.2.5 POD 活性测定和蛋白质含量测定
• 1.3 POD 最适反应温度
• 1.4 POD 热稳定性研究
• 1.5 POD 最适pH 研究
• 1.6 POD 的pH 稳定性研究
• 1.7 不同化合物对POD 活性的影响
• 1.8 POD 动力学研究
• 1.9 底物亲和性研究
• 2 结果和分析
• 2.1 POD 的分离纯化
• 2.2 POD 纯度的鉴定
• 2.3 莲藕组织POD 性质研究
• 2.3.1 POD 最适反应温度
• 2.3.2 POD 的热稳定性
• 2.3.3 POD 最适pH 值和对pH 稳定性
• 2.3.4 不同化合物对莲藕组织POD 活性影响
• 2.3.5 POD 动力学性质
• 3 讨论
• 3.1 鲜切莲藕组织POD 分离纯化探讨
• 3.2 鲜切莲藕组织中POD 最适反应条件
• 3.3 鲜切莲藕组织中POD 稳定性
• 3.4 不同化合物对鲜切莲藕组织中POD 活性影响
• 第四章 鲜切莲藕片褐变及其方向性的控制
• 第一节 抗坏血酸处理对鲜切莲藕片变色控制研究
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料和预处理
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 褐变指数的确定
• 1.2.2 PAL、PPO 和POD 的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 抗坏血酸处理对鲜切莲藕褐变指数的影响
• 2.2 抗坏血酸处理对鲜切莲藕PAL 活性的影响
• 2.3 抗坏血酸处理对鲜切莲藕PPO 活性的影响
• 2.4 抗坏血酸处理对鲜切莲藕POD 活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 抗坏血酸处理对鲜切莲藕褐变的影响
• 3.2 抗坏血酸处理对PAL 活性的影响
• 3.3 抗坏血酸处理对鲜切莲藕组织PPO/POD 活性的影响
• 4 结论
• 第二节 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕变色控制研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料预处理
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 腐烂率和腐烂指数
• 1.2.2 失重率
• 1.2.3 表面水分含量
• 1.2.4 色度的测定
• 1.2.5 其它指标测定
• 2 结果和分析
• 2.1 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕色度的影响
• 2.2 壳聚糖处理对鲜切莲藕贮藏期间腐烂率的影响
• 2.3 壳聚糖处理对鲜切莲藕贮藏期间失重率的影响
• 2.4 壳聚糖对鲜切莲藕贮藏期间表面水分的影响
• 2.5 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕膜透性的影响
• 2.6 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕表面总酚的影响
• 2.7 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕表面褐变相关酶的影响
• 2.7.1 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕表面PAL 活性影响
• 2.7.2 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕表面PPO 的影响
• 2.7.3 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕表面POD 活性的影响
• 2.8 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕膜脂过氧化的影响
• 2.8.1 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕表面LOX 活性的影响
• 2.8.2 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕表面MDA 含量的影响
• 3 讨论
• 3.1 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕变色方向性及褐变的影响
• 3.2 壳聚糖涂膜处理对鲜切莲藕失重的影响
• 3.3 壳聚糖涂膜处理对腐烂的影响
• 3.4 壳聚糖涂膜处理延缓鲜切莲藕褐变的机理
• 3.5 壳聚糖涂膜处理控制鲜切莲藕变色方向性的机理
• 第三节 食用乙酸对鲜切莲藕的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料预处理
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 pH 的测定
• 1.2.2 扫描电镜观察
• 1.2.3 其它指标的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 食用乙酸对鲜切莲藕色泽的影响
• 2.2 食用乙酸对鲜切莲藕腐烂情况的影响
• 2.3 食用乙酸处理对鲜切莲藕表面pH 的影响
• 2.4 食用乙酸处理对鲜切莲藕水分及相关指标的影响
• 2.4.1 食用乙酸对鲜切莲藕失重的影响
• 2.4.2 食用乙酸对鲜切莲藕表面水分的影响
• 2.4.3 食用乙酸对鲜切莲藕表面膜透性的影响
• 2.5 食用乙酸处理对鲜切莲藕表面总酚含量的影响
• 2.6 食用乙酸对鲜切莲藕表面褐变相关酶活性的影响
• 2.6.1 食用乙酸对鲜切莲藕表面PAL 活性影响
• 2.6.2 食用乙酸处理对鲜切莲藕表面PPO 活性的影响
• 2.6.3 食用乙酸对鲜切莲藕表面POD 活性的影响
• 2.7 食用乙酸对鲜切莲藕表面膜脂过氧化影响研究
• 2.7.1 食用乙酸处理对鲜切莲藕表面LOX 活性影响
• 2.7.2 食用乙酸处理对鲜切莲藕表面MDA 含量的影响
• -1 影响'>2.7.3 食用乙酸处理对鲜切莲藕表面O2·^-1影响
• 2.8 食用乙酸对鲜切莲藕表面结构的影响
• 3 讨论
• 3.1 食用乙酸对鲜切莲藕色泽影响
• 3.2 食用乙酸对鲜切莲藕腐烂的影响及机理探讨
• 3.3 食用乙酸对鲜切莲藕膜透性和表面水分的影响
• 3.4 食用乙酸处理对褐变相关酶活性的影响
• 3.5 壳聚糖和乙酸在防止鲜切莲藕变色方向性的作用探讨
• 结论
• 本论文的创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C 图片