重组脂肪酶基因工程菌的构建及重组酶的应用

论文摘要

南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）是一种能催化水解、酯化、转酯化等反应,催化活性高,底物谱广泛的脂肪酶,无论在酶学理论研究和实际工业生产领域,它都是广受欢迎的生物催化剂。尤其是非水酶学的发展,更加推动了 CALB在各领域中的应用,其中利用CALB催化合成维生素A酯类衍生物就是其重要用途之一。维生素A酯类衍生物常用作食品、化妆品等的添加剂。基于维生素A醋酸酯的性质不稳定,但其工业生产路线较成熟等因素,利用维生素A醋酸酯为底物合成稳定性较好的维生素A棕榈酸酯成为研究的发展趋势。本论文从实验室保藏的原始菌株C.antarcticaZJB09193出发,利用RT-PCR技术,成功克隆了 CALB编码基因,并通过载体pPICZαA成功构建了产CALB的重组毕赤酵母X33/CALB。对重组菌在摇瓶和发酵罐中的生长产酶曲线进行了测定,其酶活和生物量分别为0.8 U·mL-1,19.1g·L-1和5.16 U·mL-1,80.2g·L-1。再利用微滤、超滤及镍离子亲和层析等技术对重组脂肪酶进行分离纯化,酶的纯化倍数为7.6倍,收率为52.9%,其最高比酶活为7.7 U.mg-1。以对硝基苯酚乙酸酯（p-NPA）为底物对重组脂肪酶的酶学特性进行研究,结果表明其最适反应pH为8.0,最适反应温度为52 ℃,该酶在pH 5～9范围内比较稳定,对热较为敏感。大部分金属离子在低浓度（1 mmol.L-1）的情况下对酶活都有促进作用,但当浓度提高时（10 mmol·L-1）,又能抑制重组脂肪酶的活性,其中Co2+几乎不影响该酶的活性。吐温-80和SDS能抑制该酶的活性。以p-NPA为底物的动力学常数 Km 和 Vm 分别为 0.34 mmol·L-1 和 7.36 μmol·min-1·mg-1。游离酶在有机相中不溶解而结块造成催化效率的降低,且产物分离时步骤繁琐,可通过固定化技术克服此缺点。利用市售织物膜（布料）为载体,吸附法制备固定化酶,最佳固定化条件为:以棉2（全棉材质,织法32织3）为载体,1:7的比例与共固定剂混合,每克活化棉布加入584 U的酶,固定化时间为10 h。利用固定化酶催化合成维生素A棕榈酸酯,其最佳反应条件是:25℃,180rpm条件下,以正己烷为反应溶剂,维生素A醋酸酯和棕榈酸的浓度分别为100 mmol.L-1和300 mmol.L-1,固定化酶用量为130 g·L-1,催化转酯反应12h,转化率可达为77%;同时研究了固定化酶的在转酯化反应过程中的底物特异性,结果表明其能利用对大部分长链脂肪酸完成转酯反应;最后对固定化脂肪酶催化维生素A棕榈酸酯合成的反应动力学进行了研究,表明该反应属于双底物乒乓机制,Vmax为19.2μmol·min-1·g-1、KmA和KmB分别为 0.086 mol L-1、0.072 mol L-1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 南极假丝酵母脂肪酶B
• 1.1.1 南极假丝酵母脂肪酶B的概述
• 1.1.2 南极假丝酵母脂肪酶B的催化反应机制
• 1.1.3 南极假丝酵母脂肪酶B的基因工程研究
• 1.1.4 南极假丝酵母脂肪酶B的应用
• 1.2 毕赤酵母表达系统
• 1.2.1 背景介绍
• 1.2.2 毕赤酵母表达宿主菌
• 1.2.3 毕赤酵母表达载体及外源基因整合方式
• 1.2.4 毕赤酵母表达系统的应用实例（脂肪酶在毕赤酵母中的表达）
• 1.3 维生素A及其衍生物
• 1.3.1 维生素A及其衍生物的简介
• 1.3.2 维生素A的化学合成
• 1.3.3 维生素A棕榈酸酯的简介
• 1.3.4 维生素A棕榈酸酯的合成
• 1.4 本论文的选题意义及研究内容
• 1.4.1 本论文的选题意义
• 1.4.2 本论文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆与表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌种和载体
• 2.2.2 主要工具酶和试剂
• 2.2.3 培养基及溶液配置
• 2.2.4 主要实验仪器
• 2.2.5 C.Antarctica ZJB09193总RNA的提取
• 2.2.6 RNA甲醛变性电泳
• 2.2.7 C.Antarctica ZJB09193脂肪酶B cDNA的合成
• 2.2.8 C.Antarctica ZJB09193脂肪酶B基因的克隆
• 2.2.9 大肠杆菌E.coli JM109感受态的制备及转化
• 2.2.10 C.Antarctica ZJB09193脂肪酶B表达载体的构建
• 2.2.11 重组表达载体pPICZα A-CALB的提取
• 2.2.12 重组表达载体pPICZα A-CALB的酶切鉴定
• 2.2.13 重组表达载体pPICZα A-CALB的转化
• 2.2.14 重组脂肪酶的诱导表达及SDS-PAGE分析
• 2.2.15 生物量的测定
• 2.2.16 重组脂肪酶的酶活检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 RNA的提取
• 2.3.2 cDNA的合成及克隆
• 2.3.3 CALB表达载体的构建及鉴定
• 2.3.4 毕赤酵母的电转化
• 2.3.5 重组脂肪酶的诱导表达
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 重组脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基及其配制
• 3.2.3 主要实验仪器
• 3.2.4 重组脂肪酶活力的测定
• 3.2.5 蛋白质浓度的测定
• 3.2.6 重组脂肪酶的分离纯化
• 3.2.7 重组脂肪酶的酶学性质研究
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 重组脂肪酶的分离纯化
• 3.3.2 重组脂肪酶最适pH的测定
• 3.3.3 重组脂肪酶的pH稳定性
• 3.3.4 重组脂肪酶最适温度的测定
• 3.3.5 重组脂肪酶的热稳定性
• 3.3.6 金属离子和表面活性剂对重组脂肪酶酶活的影响
• 3.3.7 酶反应动力学
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 固定化脂肪酶的应用—维生素A棕榈酸酯的酶法合成
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 主要实验仪器
• 4.2.3 固定化脂肪酶的制备
• 4.2.4 固定化脂肪酶合成维生素A棕榈酸酯的条件优化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 载体的选择
• 4.3.2 载体与共固定剂的质量体积比影响
• 4.3.3 活化棉布的最优加酶量
• 4.3.4 固定化时间的影响
• 4.3.5 有机溶剂的影响
• 4.3.6 温度的影响
• 4.3.7 固定化酶用量的影响
• 4.3.8 底物摩尔比的影响
• 4.3.9 反应初始加水量的影响
• 4.3.10 反应进程
• 4.3.11 固定化酶稳定性的研究
• 4.3.12 脂肪酸碳链长度的影响
• 4.3.13 反应动力学机制
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 攻读学位期间所取得的相关科研成果
• 致谢