棉花生长素应答因子的克隆及其功能初步分析

论文摘要

棉花是一种重要的全球性的经济作物。棉花纤维以其好的保暖性、保湿性、透气性等不可为其它纤维代替的优点,越来越受到世界各国的重视。同时人们对纤维品质的追求,也越来越高。随着分子生物学的发展,利用基因工程改良棉纤维品质展现了广阔的前景。如通过分离鉴定棉纤维发育相关的基因,并导入棉花中,使其过量或缺失表达,影响纤维的发育。虽然对棉花纤维的改良已有很多成功的例子,但是还未见从生长素响应因子（ARF,auxin response factor）方面的报道。生长素在植物的生长和发育过程中起着关键的作用。据报道,生长素促进纤维细胞的伸长。纤维原始细胞在开花前3天到前2天,可以由于IAA的刺激从而获得细胞延伸的生理能力。开花前后可以由于外施IAA,明显增加胚珠的纤维数量。ARF是生长素信号转导途径中的关键因子,它可以接受生长素传递的信号,启动或是抑制下游基因的表达。本研究通过电子克隆技术和生物信息学知识,结合RACE技术,克隆到了一个棉花中的新ARF基因,命名为ARF3（GENBANK登录号为:EF467605）,并根据已知的序列,通过RT-PCR的方法获得了棉花中ARF10基因含完整读码框的cDNA序列。将以上获得的cDNA序列克隆到pCAMBIA1301表达载体上,构建了pCAMBIA1301-ARF3和pCAMBIA1301-ARF10植物表达载体。在农杆菌GV3101介导下,通过真空渗透转化技术转化模式植物拟南芥,得到了批量的转基因植株。ARF3转基因植株经抗性筛选,得到了12株T1代转基因植株;ARF10转基因植株经抗性筛选,得到11株T1代转基因植株。PCR检测证明,目的基因已成功导入模式植物拟南芥中;RT-PCR检测目的基因在转基因植株中得到表达。对转基因植株表型的观察,在得到转基因植株纯合子之后进行。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 棉花纤维的发育过程
• 1.1.1 棉纤维发育的起始
• 1.1.2 棉纤维的伸长
• 1.1.3 棉纤维的次生壁增厚
• 1.1.4 脱水成熟
• 1.1.5 利用基因工程技术进行棉纤维品质改良的途径和可行性
• 1.2 生长素信号转导研究进展
• 1.2.1 植物生长素信号传导途径
• 1.2.2 植物生长素响应因子（ARF）的生物学功能
• 1.2.3 展望和存在的问题
• 1.3 生长素与棉纤维发育关系的研究
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 培养基以及抗生素
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基本试验操作
• 2.2.2 ARF3 克隆及表达
• 2.3 ARF10 的克隆和表达
• 2.3.1 ARF10 全长序列的 cDNA 克隆
• 2.3.2 全长序列分析
• 2.3.3 表达载体构建
• 2.3.4 转化拟南芥以及转基因植株筛选
• 2.3.5 转基因检测
• 3 结果和分析
• 3.1 ARF3 基因克隆与表达
• 3.1.1 陆地棉总RNA 提取
• 3.1.2 RACE 克隆基因5’端
• 3.1.3 序列拼接及基因全长克隆结果
• 3.1.4 序列分析
• 3.1.5 表达载体的构建
• 3.1.6 转基因植株的筛选
• 3.1.7 转基因植株表型观察
• 3.2 ARF10 的克隆与表达
• 3.2.1 基因克隆
• 3.2.2 序列分析
• 3.2.3 表达载体构建
• 3.2.4 转基因植株筛选
• 3.2.5 转基因植株检测
• 3.2.6 转基因植株表型观察
• 4 讨论
• 4.1 关于 RACE 技术
• 4.2 关于表达载体的构建
• 4.3 关于真空抽转化法
• 4.3.1 真空抽转化法
• 4.3.2 转化的适宜时期
• 4.4 对克隆基因的分析讨论
• 4.5 后续对转基因植株的表型观察
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢