自噬调节全反式维甲酸诱导髓系白血病细胞分化的机制研究

论文摘要

急性早幼粒细胞性白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）是一类特殊的急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia, AML）。PML-RARα融合蛋白导致APL的发生。全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid, ATRA）可以通过PML-RARα融合蛋白降解促进细胞分化成熟使APL达到临床缓解。自噬能促进PML-RARα融合蛋白的降解,但目前尚不清楚自噬参与PML-RARα融合蛋白的降解的具体机制和作用。首先,本研究以NB4细胞和HL-60细胞为研究对象,运用免疫荧光法,Western blotting、流式细胞仪及透射电镜分析等实验方法,观察ATRA诱导髓系白血病细胞发生自噬的情况。研究结果显示治疗剂量下ATRA诱导髓细胞发生自噬；相反,添加自噬抑制剂（3-MA）后能抑制自噬的发生。进一步利用白血病细胞系,分析了自噬相关基因在ATRA诱导髓系白血病细胞自噬中的作用。研究发现采用RNA干扰技术降低自噬相关基因在细胞中的表达后,抑制了ATRA诱导细胞产生的自噬,并且导致细胞凋亡增加。其次,为了进一步探讨自噬在ATRA诱导髓系白血病细胞分化中的作用,本研究采用流式细胞学和细胞形态学,发现在ATRA干预细胞时,同时加白噬抑制剂（3-MA）后能抑制ATRA诱导细胞分化成熟；相反,同时加自噬诱导剂（雷帕霉素）能促进ATRA诱导细胞分化成熟。再用RNA干扰技术,抑制自噬相关基因的表达,在诱导分化剂作用下能有效抑制髓系白血病细胞分化。以上结果证明了自噬调节ATRA诱导的细胞分化。最后,本研究发现自噬在髓系白血病细胞中调节ATRA诱导的PML-RARα融合蛋白降解；p62与PML-RARα融合蛋白结合调节PML-RARα融合蛋白降解和髓系白血病细胞分化。本研究先利用蛋白酶、caspases或自噬等抑制剂分别阻断蛋白降解途径,通过Western blotting分析发现ATRA可诱导PML-RARα融合蛋白降解。再采用RNA干扰、免疫荧光等技术,使自噬相关蛋白Atg5表达抑制,减少了PML-RARα融合蛋白降解和抑制自噬发生。然后利用免疫共沉淀技术,发现p62/SQSTM1与PML-RARα融合蛋白结合,免疫荧光技术显示两者在细胞中共定位。RNA干扰后p62表达抑制,抑制了细胞的分化和PML-RARα融合蛋白降解；相反,采用基因转染技术,使p62过表达,增加PML-RARα融合蛋白传送到溶酶体。研究显示出细胞中适当p62水平维持PML-RARα融合蛋白在一定水平,从而调节髓系白血病细胞分化成熟,这一过程是通过蛋白酶体和自噬溶酶体两条通路共同完成的。综上所述,ATRA抑制mTOR通路并激活了Atg1-PI3KC3-Atg5自噬通路,此通路促进自噬体发生；确认了p62与PML-RARα融合蛋白在细胞内相互作用调节PML-RARα融合蛋白降解。低表达的p62抑制了PML-RARα融合蛋白的降解；相反,抑制自噬发生导致p62在胞内聚集,通过一个负反馈机制抑制蛋白酶体活性和PML-RARα融合蛋白降解。因此,自噬在p62调节PML-RARα融合蛋白降解和髓系白血病细胞分化中发挥重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 前言
• 第一章 ATRA对髓系白血病细胞自噬的影响
• 1. 材料与方法
• 2 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第二章 自噬调节ATRA诱导的髓系白血病细胞分化
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第三章 自噬调节髓系白血病细胞分化的分子机制
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 总结论
• 参考文献
• 综述 自噬在肿瘤中的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果